王 仲，金琦芳，段振华

（贺州学院 食品与生物工程学院，广西 贺州 542800）

石崖茶是山茶科杨桐属亮叶杨桐（Adinandra nitida）嫩梢制成的代茶，在广西多地有分布，民间用来消炎、解毒、杀菌、镇痛等[1-2]。现代研究表明，石崖茶抗氧化能力优于普通绿茶，其中茶汤中黄酮化合物起到较大作用[3-4]。且石崖茶比普通茶叶咖啡因含量低，低至1.74%，可作为因咖啡因引起中枢神经兴奋而失眠的饮茶人群良好的替代茶饮[5-6]。研究表明石崖茶中总黄酮含量可高达28.4%，是目前已知黄酮含量最高的植物，具有抗氧化[7-8]、清除自由基[9-10]、抗菌[8,11]、降血脂[12]、降血糖[13]和抗肿瘤[7,14]等保健和药用价值。目前，石崖茶中黄酮类化合物成分鉴定和含量测定方法主要有液质联用[15-16]、HPLC法[17]和UPLC法[18]等，虽然这些方法检测结果精确度较高，但是对大型试验仪器的依赖性大。本研究参考其他植物超声波辅助乙醇浸提总黄酮工艺[19-20]，优化石崖茶总黄酮提取工艺，得出一种仪器要求简单、提取效率高的总黄酮提取工艺，并比较广西金秀、昭平和桂平地区石崖茶总黄酮含量，为进一步推广和利用该优异植物资源提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为石崖茶春茶，产自金秀、桂平和昭平地区。

1.2 试验方法

1.2.1 主要试剂和仪器

所有化学试剂均为分析纯，芦丁标准品（HPLC＞98%）购自合肥博美生物科技有限责任公司。主要仪器有722型分光光度计、循环水式真空泵、高速多功能粉碎机、电子天平、超声波清洗器、电热恒温干燥箱、40目筛等。

1.2.2 总黄酮的测定

标准品溶液配制。精密称取20.0 mg于120℃干燥至恒重的芦丁标准品，加140 mL体积分数为70%的乙醇，微热水浴使溶解，放置至室温后，加70%的乙醇定容至200 mL，摇匀，制得0.1 mg/mL标准品溶液。

标准曲线制作。精密量取0.0 mL、10.0 mL、15.0 mL、20.0 mL、25.0 mL和30.0 mL标准品溶液于50 mL容量瓶中，用浓度为70%的乙醇溶液补充至30 mL。各精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，充分摇匀，静止6 min后各精确加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，充分摇匀，静止6 min后各加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL，用浓度为70%的乙醇溶液定容至刻度，充分摇匀，静置15 min后使用紫外分光光度计在510 nm处测量吸光度值，以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线（图1）。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of tutin

总黄酮的测定。准确称取石崖茶粉末1.0 g，以乙醇溶液为溶剂，经超声波辅助提取，抽滤后取滤液备用。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法测定总黄酮的吸光度值[21]，根据芦丁标准曲线计算出总黄酮的含量。

1.2.3 单因素试验

考察在乙醇浓度50%、超声时间20 min和超声温度30℃条件下，不同料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60对总黄酮提取率的影响；考察在料液比1∶50、超声时间20 min和超声温度30℃条件下，不同乙醇浓度50%、60%、70%、80%和90%对总黄酮提取率的影响；考察在乙醇浓度50%、料液比1∶50和超声温度30℃条件下，不同超声时间10 min、20 min、30 min、40 min和50 min对总黄酮提取率的影响；考察在乙醇浓度50%、料液比1∶50和超声时间20 min条件下，不同超声温度25℃、35℃、45℃、55℃和65℃对总黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，进行四因素三水平正交试验L9（34）设计（表2），考察料液比（A）、乙醇浓度（B）、超声时间（C）和超声温度（D）四因素对总黄酮提取率的影响。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for Adinandra nitida fl avonoids extraction

1.2.5 不同产地石崖茶总黄酮含量测定

采用最优提取方案测定并比较广西金秀、桂平和昭平三个产地的石崖茶总黄酮含量。

1.3 数据处理

数据采用SPSS20.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对石崖茶总黄酮提取率的影响

由图2可看出，随着溶剂用量增大，石崖茶中总黄酮提取率增大，在料液比为1∶50时提取率最高，提取率为26.2%，继续增加溶剂用量提取率呈下降趋势；提取率下降可能是由于增大溶剂用量使相同超声时间内黄酮提取的超声辅助效果减弱，导致提取不充分。因此，确定1∶50作为单因素试验中的最适料液比，并选取料液比1∶40、1∶50和1∶60这3个水平进行正交试验。

图2 料液比对石崖茶总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.2 乙醇浓度对石崖茶总黄酮提取率的影响

由图3可看出，乙醇浓度在50%～70%范围内时，石崖茶总黄酮提取率随乙醇浓度增大而增大，乙醇浓度为70%时，提取率达到最高（27.55%）；随着乙醇浓度进一步增大，提取率呈现下降趋势。因此，确定合适的乙醇浓度在70%左右，选取乙醇浓度60%、70%和80%这3个水平进行正交试验。

图3 乙醇浓度对石崖茶总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.3 超声时间对石崖茶总黄酮提取率的影响

由图4可看出，超声时间为30 min时，提取率最大，为27.76%；再延长超声时间，提取率呈下降趋势。分析认为，超声时间对石崖茶总黄酮提取率有明显影响，超声时间短时，提取不充分；超声时间过长，可能会使黄酮遭到破坏，使提取率呈现下降趋势。因此，确定合适的超声时间在30 min左右，后续试验中选取超声时间20 min、30 min和40 min这3个水平进行正交试验。

图4 超声时间对石崖茶总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.4 超声温度对石崖茶总黄酮提取率的影响

由图5可以看出，温度对提取率有较大的影响，随着超声温度的升高，提取率先升高，然后降低，在55℃时提取率达到峰值（27.01%）。分析认为，可能是一些黄酮类物质在过高的温度条件下会随着温度的继续升高而被破坏，从而导致黄酮的提取率降低。因此，确定合适的超声温度在55℃左右，后续试验中选取超声温度45℃、55℃和65℃这3个水平进行正交试验。

图5 超声温度对石崖茶总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield ofAdinandra nitida fl avonoids

2.2 正交试验结果

由表2极差分析结果可知，试验考察的影响石崖茶总黄酮提取率的4个因素中，影响大小为：料液比＞超声温度＞超声时间＞乙醇浓度。由各因素的极差及均值综合分析可得，超声辅助提取石崖茶总黄酮的最优提取方案应为A1D2C2B2，即料液比1∶40、乙醇浓度70%、超声时间30 min和超声温度55℃。正交试验中的试验2恰为最佳方案因素组合，是正交试验9组试验中最好的结果。进一步根据最优方案进行验证试验，重复5次，得到石崖茶总黄酮平均提取率为30.32%，RSD=0.34%。结果表明，优化后的提取方案重复性好，提取率优化效果明显。因此，本试验优化方案可用于石崖茶总黄酮的提取。

表2 总黄酮提取率影响因素正交试验结果Table 2 Flavonoids extraction rate factors orthogonal test results

2.3 不同产地石崖茶总黄酮含量比较

采用正交试验优化后的提取方案，提取测定广西昭平、桂平和金秀三个产区石崖茶产品的总黄酮含量。测定结果（图6）表明，昭平、桂平和金秀石崖茶总黄酮含量存在差异，其中产自昭平的石崖茶总黄酮含量为30.4%，产自桂平的石崖茶总黄酮含量为27.4%，产自金秀的石崖茶总黄酮含量为25.6%。差异显著性分析结果表明，不同产地来源的石崖茶总黄酮含量之间存在极显著差异。

图6 不同产地石崖茶总黄酮含量比较Fig. 6 Comparison of the total fl avonoids content of Adinandra nitida from different areas

3 结论

本试验采用超声波辅助提取石崖茶总黄酮，以石崖茶总黄酮提取率为指标，分别进行料液比、乙醇浓度、超声时间和超声温度4个因素对总黄酮提取率影响的研究。在单因素试验的基础上，进行正交试验，分析得出石崖茶总黄酮的超声波辅助提取工艺中4个因素对石崖茶总黄酮提取率影响大小为：料液比＞超声温度＞超声时间＞乙醇浓度，提取工艺最优条件为：料液比1∶40、乙醇浓度70%、超声时间30 min、超声温度55℃。该石崖茶总黄酮提取工艺具有提取率高、提取时间短及操作简单方便等优点。通过比较昭平、桂平和金秀三个产地的石崖茶总黄酮含量，其中昭平的含量最高，具有潜在的推广种植与开发利用优势。