金慧慧

（温州市龙湾区疾病预防控制中心，浙江温州 325024）

作为真菌毒素重要代表的黄曲霉毒素，是至今为止发现的毒性最大的真菌毒素，是世界公认的3大强致癌物质之一，已被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构认定为IA级危险物，对肝脏影响最大，并有致畸、致突变、致癌的作用。天然产生的黄曲霉毒素根据其化学结构不同分为B1、B2、G1、G24种。随着老百姓对食品安全关注度的不断提高，保证食品质量安全变得尤为重要。黄曲霉毒素污染食品的种类繁多，为了适应不同的检测目的和要求，黄曲霉检测的新方法、新手段也随之快速改进。目前，黄曲霉毒素B族和G族的检测方法主要为GB/T 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》。本文采用的是第三法 高效液相色谱-柱后衍生法中的柱后碘衍生法。经过多次测定不同类别的样品，发现在均质步骤，目标物损失较多，经改变方法，通过2次均质定容，均质2次，第2次主要用于冲洗刀头再合并均质液以提高回收率，回收率在87.1%～123.1%之间。国标上用内径4.6mm的C18柱需进样50μL，碘液浓度需要0.05%，碘液流速0.2mL/min，试剂浪费严重，而且碘溶液易污染环境。此外对于需要多次测定同一样品来计算RSD时，进样50μL可能导致样品不够而引发测量结果不准确，现将色谱柱换成Waters Carbamate Analysis柱，进样量改为10μL，碘液浓度改为0.02%检测进样，试验结果表明，黄曲霉毒素B1、G1检出限可达0.4 ng/mL，B2、G2检出限可达0.2 ng/mL，此方法适用于花生酱、花生、大米等食品中黄曲霉毒素的测定。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters IClass型高效液相色谱仪，配有2475荧光检测器；AL204电子天平，精度0.1mg；T25型均质器，德国I K A公司。

1.2 试剂

黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2混标，46300-USUP ELCO，含量为98%～99%，黄曲霉毒素B1和G1分别为0.932μg/mL和0.876μg/mL，黄曲霉毒素B2和G2分别为0.309mg/L和0.265mg/L，规格为每支1mL；免疫亲和柱，Afla StarTMR，Romer Labs公司；甲醇，色谱纯，莫克公司；水，超纯水；碘，分析纯。样品来源于本科室所抽样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Carbamate Analysis柱，150mm×3.9mm；甲醇 + 乙腈 （1∶1）：水为 35∶65；激发波长：360 nm；发射波长：440 nm；流量：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；衍生溶液：0.02%碘溶液。

2.2 样品前处理方法

采取免疫亲和层析法，该方法特异性强、净化效果出色、操作简单。称取5 g左右研磨均匀的大米样品于50mL离心管中，加入10mL（甲醇+水）（60+40） 均质提取3min。另取一干净50mL离心管，里面加入10mL（甲醇+水）（60+40） 冲洗刀头，均质3min，将此均质液倒入初次均质的离心管内，合并均质液，玻璃纤维滤纸过滤。取10mL滤液与20mL纯水混合，备用。将50mL注射器筒与免疫亲和柱顶部相连，将亲和柱放置于固相萃取装置上，移取15mL上述滤液稀释液到注射器筒内，放空亲和柱柱内液体，调节下滴速度，使液体以1～2滴/s速度过柱，待样液流完后，加入20mL纯水，以稳定流速洗涤免疫亲和柱，待柱内液体被抽干后，在亲和柱下面放置10mL刻度试管，然后用1.5mL甲醇分3次洗脱黄曲霉毒素，将洗脱液全部收集于10mL刻度试管中，整个洗脱时间不小于60 s。在50℃下氮吹吹至0.5mL以下，用甲醇定容至0.5 mL再用纯水定容至1mL，漩涡30 s溶解残留物，经孔径0.22μm滤膜过滤后待测。分别将标准点1（Std1）、标准点3（Std3） 平行测定6次，计算RSD。另取1份5 g左右均匀研磨大米样品向内加入0.002 5mL黄曲霉混标制备加标液1，取1份5 g左右均匀研磨大米样品向内加入0.025mL黄曲霉混标制备加标液2，同样按上述样品净化步骤操作待测，计算加标回收率。

2.3 色谱分析

高效液相色谱法结合荧光检测器检测黄曲霉毒素是国际上比较常用的方法。分别将标准溶液及处理后的样品进行荧光分析，峰面积外标法定量,计算样品中黄曲霉毒素的含量。

2.4 试验结果

2.4.1 线性关系考察

以样品黄曲霉毒素含量为横坐标、峰面积为纵坐标，进行线性回归，标准曲线见表1，回归方程见表2。标准曲线Std1点色谱图见图1。

图1 标准曲线Std1点色谱图

表1 黄曲霉毒素标准曲线配制表

表2 黄曲霉毒素线性回归方程

2.4.2 方法的检出限、精密度和回收率

大米样品本底图谱见图2。向空白本底样品中分别加标0.002 5mL、0.025mL黄曲霉混标，黄曲霉毒素图谱见图3、图4。加标低于0.002 5mL黄曲霉混标时得不到黄曲霉毒素的图谱，因此将黄曲霉毒素 G2，G1，B2，B1方法检出限分别定为 B1：0.4 ng/mL（0.406 ng/mL），B2：0.2 ng/mL（0.165 ng/mL），G1： 0.4 ng/mL （0.385 ng/mL） ， G2： 0.2 ng/mL（0.154 ng/mL）。黄曲霉素Std1、Std3平行测定6次其相对标准偏差在0.9%～8.4%，结果分别见表3、表4。对样品进行高、低2个浓度的加标试验, 其加标回收率在80.2%～116.2%，分别见表5、表6。

图2 大米样品本底图谱

表3 黄曲霉毒素Std16次平行测定精密度

表4 黄曲霉毒素Std36次平行测定精密度

表5 黄曲霉毒素混标原液加标0.002 5m L回收率

图3 黄曲霉毒素混标原液加标0.002 5m L图谱

表6 黄曲霉毒素混标原液加标0.025m L回收率

图4 黄曲霉毒素混标原液加标0.025m L图谱

2.4.3 样品测定

采用本方法共测定448份食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中加工坚果类94份，五谷杂粮类270份，调料类50份，植物油34份。测定结果表明，30份花生酱中均检出黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，22份花生米中检出黄曲霉毒素B1、G1，5份葵花籽中检出黄曲霉毒素B1、G2，13份玉米粉中检出黄曲霉毒素B1、G2，6份大米均检出黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，1份薏仁米均检出黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，4 份小麦粉检出黄曲霉毒素 B1、B2、G1，10份豆瓣酱检出黄曲霉毒素B2，12份黄豆酱检出B1，15份豆腐乳检出黄曲霉毒素B1、B2、G1。

3 讨论

该方法建立了用H P LC法检测4种黄曲霉毒素的含量，该方法操作简单，测定结果可靠，能够完成对黄曲霉毒素的检测。经过多次测定不同类别的样品，发现在均质步骤，目标物损失较多，经改变方法，通过2次定容，均质2次，第2次主要用于冲洗刀头再合并均质液以提高回收率，回收率在80.2%～116.2%之间。国标上用内径4.6mm的C18柱需进样50μL，碘液浓度需要0.05%，碘液流速0.2mL/min，试剂浪费严重，而且碘溶液易污染环境。此外对于需要多次测定同一样品来计算RSD时，进样50μL可能导致样品不够而使测量结果不准确，现将色谱柱换成Waters Carbamate Analysis柱，进样量改为10μL，碘液浓度改为0.02%检测进样。试验结果表明，黄曲霉毒素B1、G1检出限可达0.4 ng/mL,黄曲霉毒素B2、G2检出限可达0.2 ng/mL，此方法适用于花生酱、花生、大米等食品中黄曲霉毒素测定。