王朋朋, 徐 佳, 张丽梅, 张淑华, 王丽萍,

(1. 长春理工大学 生命科学技术学院, 长春 130022; 2. 吉林大学 生命科学学院, 长春 130012；3. 新时代健康产业(集团)有限公司, 北京 102206)

药食同源[1]植物指既可食用又可药用的植物. 刺梨(Rosaroxburghii)、干姜(Zingiberoj-jicinaleRosc.)、肉桂(CinnamomumcassiaPresl)、山药(Dioscoreaerhizoma)和葡萄籽(grape seed)均为药食同源植物. 刺梨鲜果含钙、铁、碘、锌和硒等多种微量元素及与丰富的营养物质, 并含有多超氧化物歧化酶(SOD)和总黄酮[2]等活性成分, 具有抗辐射、消炎、抗癌等功效. 干姜主要含有姜辣素类、挥发油类、二苯基庚烷类等化学活性成分及少量的糖苷类、黄酮类、氨基酸、多种维生素等[3], 具有抑菌消炎、降脂降糖[4-5]、抗肿瘤[6]等功效. 肉桂主要含有肉桂精油、黄酮类、油树脂、多糖、多酚等生理活性物质[7], 具有消炎、降糖、抗肿瘤[8]等功效. 山药含有蛋白质、3,4-二羟基苯乙胺、维生素、植酸、胆碱、多巴胺、山药碱等有效成分, 具有抗衰老、降糖降脂、抑肿瘤等功效[9]. 葡萄籽是葡萄的种子, 含有丰富的氨基酸、维生素、多酚类及矿物质[10], 具有抗衰老、抗氧化[11]、抗肿瘤[12]等功效. 本文以典型抗氧化实验动物----秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans, 线虫)为模式生物, 以5种药食同源植物刺梨、干姜、肉桂、山药、葡萄籽为原料, 采用水提法获得各自有效成分, 通过对受试C.elegans的寿命实验、体外氧化压力实验及C.elegans体内自由基的测定, 综合评估5种药食同源植物的抗氧化作用.

1 材料和方法

1.1 仪器材料与试剂

电子分析天平(sartorius BT25S型, 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)； 数显恒温水浴锅(HH-4型, 上海比朗仪器有限公司)； 高压灭菌锅(MLS-3750型, 松下健康医疗器械(上海)有限公司)； 高速低温离心机(Centrifuge 5810R型, 德国Eppendorf公司)； 鼓风干燥箱(GZX-9070 MBE型, 上海博迅实业有限公司)； 超声波细胞破碎仪(JY96-IIN型, 宁波新芝生物科技股份有限公司)； 冻干机(ALPHA 1-4 LD plus型, 德国CHRIST公司)； 生化培养箱(SPL-80型, 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)； 超净工作台(SW-CJ-1FD型, 江苏苏州净化设备有限公司)； 体视显微镜(XTL-24型, 上海普丹光学仪器有限公司)； 荧光酶标仪(FLX-800型, 美国BioTek有限公司)等.

野生型秀丽隐杆线虫(Bristol N2)、缺陷型大肠杆菌(EscherichiacoliOP50)均购于美国Caenorhabditis Genetics Center； 刺梨、干姜、肉桂、山药和葡萄籽原材料均由北京新时代健康产业(集团)有限公司提供; 胰蛋白胨、酵母抽提物均购于英国OXOID公司； 琼脂粉、胆固醇购于上海生工生物工程股份有限公司； 二氯荧光黄(DCF)购于上海试剂二厂； 其他常用试剂均为国产分析纯试剂.

1.2 方 法

1.2.1 水提物制备 分别称取一定质量的刺梨、干姜、肉桂、山药和葡萄籽, 剪刀剪碎, 研磨成粉, 在60 ℃下烘干后, 分别称取20 g粉末溶于200 mL双蒸水中, 置于超声细胞粉碎仪中, 于40 ℃, 100 Hz超声40 min后， 转置恒温培养箱于37 ℃, 200 r/min恒温震荡48 h. 离心(4 ℃, 4 000 r/min , 8 min)后取上清液, 再次离心(4 ℃, 8 000 r/min， 30 min), 取其上清液； 于冻干机中冻干后备用.

使用培养至对数生长期的OP50大肠杆菌菌液分别稀释5种水提物冻干粉, 至终质量浓度分别为0.5,1,2 mg/mL, 实验过程中现用现配； 不添加冻干粉的OP50大肠杆菌菌液作为对照.

1.2.2 线虫的培养 线虫生长培养基(NGM)： 每配制100 mL NGM培养基需称取0.30 g NaCl, 1.70 g琼脂, 0.25 g蛋白胨, 5 mg/mL胆固醇乙醇溶液100 μL, 经高压蒸汽灭菌后, 室温冷却至约55 ℃, 分别加入100 μL无菌的1 mol/L CaCl2、1 mol/L MgSO4及1 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS Buffer, pH=7.0)2.5 mL. 用无菌操作方法, 铺平板于一次性塑料平皿. 待培养基冷凝后, 在NGM固体培养基表面涂布OP50菌液(空白组)、植物水提物混合OP50菌液(实验组), 于20 ℃过夜培养后备用.

1.2.3 线虫寿命的测定 参考文献[13], 分别挑取同期化处理后的L4期线虫, 各移至涂有大肠杆菌OP50的NGM平板上进行培养, 产卵时开始计时为0 d, 每隔1 d将线虫移至相同的新NGM平板上观察, 统计线虫死亡情况, 直到受试线虫全部死亡为止(每组统计50只线虫). 以对刺激完全没有反应即认定线虫死亡. 在统计线虫死亡情况时, 不统计丢失的线虫和虫袋数据. 实验过程中, 受试线虫在生长至L4期分别进行给药, 各组给药的质量浓度均为2 mg/mL.

1.2.4 线虫体外氧化压力测定实验 随机选取10只同期化的L4期线虫转移至各给药组, 平板20 ℃培养3 d后, 转移至含有10 mmol/L过氧化氢的NGM培养基平皿中, 锡纸密封避光, 20 ℃恒温保存. 每小时观察并统计线虫的存活数量. 实验重复3次作为平行实验.

1.2.5 线虫体内自由基测定实验 参考文献[14], 采用二氯荧光黄(DCF)对受试线虫体内的活性氧自由基进行测定. 随机选取100只处于L4期的线虫(均经同期化处理)移至各给药组, 平板20 ℃培养箱培养3 d后, 分别转移至含有10 mmol/L过氧化氢的NGM液体培养基平皿中, 锡纸密封避光, 于20 ℃恒温处理1 h后, 将各组线虫先后用清水和NGM培养基各浸泡2遍, 每遍10 min, 之后移至96孔板中. 每孔分别加入50 μL NGM液体培养基和50 μL DCF, 将96孔板用锡纸包好避光, 于20 ℃, 130 r/min振荡培养1 h. 使用荧光酶标仪检测各受试组线虫体内活性氧自由基含量, 激发波长为485 nm, 阻断波长为528 nm. 实验重复3次作为平行实验.

1.3 实验数据统计

线虫寿命测定的数据采用Prism GraphPad5软件进行统计分析, 线虫存活的生长曲线采用Kaplan-Meier方法生成. 用Log-rank (Mantel-Cox) Test软件进行显著性检验. 当P<0.05*时表示具有显著性差异; 当P<0.01**时表示具有非常显著性差异.

2 结果与分析

2.1 线虫寿命的测定结果

对线虫寿命进行测定可直观评价线虫处于何种生理状态, 是对外界药物进行评估的重要参考指标之一. 外界药物可通过改变受试线虫的代谢速率、抗热激能力、抗氧化能力以及脂肪积累等调节线虫寿命[15]. 用Log-rank (Mantel-Cox) Test进行分析计算, 刺梨、葡萄籽、干姜、肉桂、山药水提物对线虫寿命的影响如图1所示. 由图1可见, 与对照组相比, 2 mg/mL的刺梨和葡萄籽水提物能非常显著延长受试线虫寿命(P<0.01), 干姜、肉桂和山药水提物对受试线虫寿命影响不明显(P>0.05).

图1 刺梨、葡萄籽水提物(A)和干姜、肉桂、山药水提物(B)对线虫寿命的影响Fig.1 Effects of R.roxburghii, grape seeds water extractions (A) and Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma water extractions (B) on lifespan of C.elegans

2.2 线虫体外氧化压力测定结果

体外氧化压力实验可通过过氧化氢、百草枯等物质诱导产生氧化压力[16]. 本文采用10 mmol/L过氧化氢分别对各组受试线虫进行处理, 即通过外界氧化压力的作用, 启动线虫本身的应激性抵抗反应功能, 在一定程度上可提升线虫的耐受能力, 但超过一定限度即导致氧化损伤. 采用5种植物提取物对线虫进行给药保护, 结果如图2所示. 由图2可见, 与对照组相比, 3种质量浓度(0.5,1,2 mg/mL)的5种植物水提物对受试线虫作用后, 均呈非常显著性差异(P<0.01). 表明在10 mmol/L过氧化氢诱导的体外氧化压力下, 5种不同种类、不同质量浓度的植物水提物均对受试线虫具有很强的氧化损伤修复能力, 且总体呈剂量-效应关系.

2.3 线虫体内自由基测定结果

自由基与生物氧化作用关系密切, 正常的生物机体需保持一定的自由基水平, 即生物体内自由基的产生和清除需维持一种动态变化的平衡关系. 若外界环境或外源物质对生物机体产生氧化压力, 则生物体内自由基的生成水平明显提高, 打破平衡状态, 导致生物体的氧化应激[17], 最终对生物体造成损害. DCF进入受试线虫体内后会被酯酶水解, 去乙酰基后形成二氯荧光黄双乙酸(DCFH), DCFH可与细胞内自由基作用, 生成有荧光的产物, 在480～520 nm条件下产生荧光, 荧光强度与自由基数量呈正相关. 先用10 mmol/L过氧化氢分别对各组受试线虫进行处理后, 自由基水平均显著增加, 再用5种植物提取物进行给药保护, 结果如图3所示.

图2 刺梨、干姜、肉桂、山药、葡萄籽水提物对氧化压力下线虫的保护作用Fig.2 Protective effects of R.roxburghii, Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma, grape seeds water extractions on C.elegans under oxidative stress

图3 刺梨、干姜、肉桂、山药、葡萄籽水提物对受试线虫体内自由基的清除能力Fig.3 Free radical scavenging abilities of R.roxburghii, Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma, grape seeds water extractions on tested C.elegans

由图3可见, 与对照组相比, 0.5,1,2 mg/mL的5种植物水提物均对受试线虫体内的自由基具有一定的清理能力, 且符合剂量-效应关系. 其中1 mg/mL的刺梨水提物和1 mg/mL的葡萄籽水提物与对照组相比具有显著差异； 2 mg/mL的刺梨水提物和2 mg/mL的葡萄籽水提物与对照组相比具有非常显著差异. 表明刺梨和葡萄籽清除受试线虫体内自由基的效果较好， 其他3种植物水提物的效果一般.

综上所述, 本文以秀丽隐杆线虫为模式动物, 通过寿命测定实验、体外氧化压力测定实验和体内自由基测定实验综合评价刺梨、干姜、肉桂、山药、葡萄籽5种药食同源植物的抗氧化效果. 实验结果表明： 2 mg/mL的刺梨和葡萄籽水提物均能非常显著延长受试线虫寿命； 5种不同质量浓度植物的水提物均对受试线虫具有显著的氧化损伤修复能力和抗氧化能力； 不同质量浓度的5种植物水提物均对受试线虫具有一定的清除体内自由基能力, 其中刺梨和葡萄籽清除自由基效果显著.