张 璐, 李绪文, 王 博, 杨艳萍, 刘佳慧, 金永日, 时晓磊

(1. 吉林大学 食品科学与工程学院, 长春 130062； 2. 吉林大学 化学学院, 长春 130012)

参类饮料是一种功能性饮料, 具有缓解体力疲劳、增强免疫力等功效. 其原材料为参类植物的根茎叶和果实[1], 工艺流程一般为浸提、调配、精滤、杀菌等. 为防治参类在种植过程中病虫害的发生, 提高产量, 一般在参类植物生长过程中大量施用农药, 其中低毒、广谱、低残留的拟除虫菊酯类农药[2-4]在参类植物的种植过程中广泛使用. 由于拟除虫菊酯类农药在参类和土壤中有一定的富集[5-7], 因此, 饮料中农药残留的测定是保证参类饮料质量的主要指标. 目前， 拟除虫菊酯类农药残留的测定方法主要有气相色谱法和液相色谱法. 气相色谱法检测灵敏度高, 但不适于具有热不稳定的农药残留测定; 由于液相色谱法的检测仪器存在最低检出限, 因此需对液体样品中的拟除虫菊酯类农药预先富集. 液体样品中拟除虫菊酯类农药残留富集的前处理方法有液-液提取法、高效体积排阻色谱法、固相萃取柱纯化法、基质固相分散法和固相萃取法等. Macedo等[8]采用基质固相分散萃取(MSPD)法进行样品的前处理, 测定了牛奶中的拟除虫菊酯类农药残留; 高晓昇等[9]采用改进的QuEChERS法进行样品前处理, 分析了牛奶中拟除虫菊酯类农药残留; 刘国平等[10]以凝胶渗透色谱净化系统(GPC)作为前处理方法, 测定了食品中的7种拟除虫菊酯类农药残留. 上述前处理方法存在需大量有机试剂以及操作繁琐等问题, 工作量巨大且易导致污染.

氧化石墨烯[11-12]是将含氧基团修饰到石墨烯表面后制得的一种吸附材料, 具有与石墨烯相似的单原子二维结构, 其表面还有大量的活性官能团[13], 如羧基、羰基、环氧基和羟基等, 这些活性官能团为吸附过程提供了更多活性位点, 因此氧化石墨烯是一种良好的吸附剂[14]. 由于其具有良好的化学稳定性、热稳定性和高比表面积等特性, 因此氧化石墨烯广泛应用于对有机小分子、金属离子与生物大分子的吸附[15-18]. 本文采用氧化石墨烯为吸附剂, 改良传统固相萃取中操作复杂、大量使用有机试剂等问题, 并通过正交实验和单因素实验, 对萃取条件进行优化, 建立了一种液体样品前处理的新方法, 为液体样品中微量农药残留的萃取和测定提供一种新思路.

1 实 验

1.1 仪器和试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)； YDO-OIR型电子天平、ZF-20D型暗箱式紫外分析仪和RE-201C型旋转蒸发仪(巩义市英峪予华仪器厂).

拟除虫菊酯类农药标准品均购于美国Sigma公司, 包括氟氯氰菊酯、七氟菊酯、氯戊菊酯、氯菊酯和联苯菊酯. 甲醇、乙腈均为色谱纯, 购于美国Sigma公司; 丙酮、氯仿、环己烷均为分析纯, 购于北京化工厂; 纯净水购于某食品公司; 花旗参茶饮料购于长春市某超市. 空白某品牌花旗参茶饮料样品(标准品)为未检出拟除虫菊酯类农药色谱峰的样品.

1.2 色谱条件

色谱柱： ZORBAX SB-C18型(5 μm, 4.6 mm×250 mm)； 流动相：V(乙腈)∶V(水)=7∶3； 检测波长220 nm； 流速1 mL/min； 进样量10 μL. 5种拟除虫菊酯标准品和样品的色谱如图1所示.

1,2. 氟氯氰菊酯； 3. 七氟菊酯； 4. 氯戊菊酯； 5,6. 氯菊酯； 7. 联苯菊酯.图1 标准品与样品的色谱Fig.1 Chromatograms of standards and samples

1.3 标准溶液配制

准确称取一定质量的氟氯氰菊酯、七氟菊酯、氯戊菊酯、氯菊酯和联苯菊酯农药标准品, 用色谱级乙腈稀释, 配制成终质量浓度为2.000 mg/mL的溶液, 4 ℃备用. 在建立标准曲线的过程中, 将2.000 mg/mL的溶液用色谱级乙腈稀释, 配制质量浓度为0.008,0.040,0.200,1.000,2.000 mg/mL的溶液.

1.4 样品的制备

将一定体积的加标花旗参茶饮料和一定量的氧化石墨烯(南京先丰纳米材料科技有限公司)置于50 mL离心管中, 混合均匀后置于摇床上振荡一定时间后离心, 用洗脱剂超声洗脱; 超声结束后, 再次离心, 取上清液, 先用氮气吹干仪吹干, 再用色谱级甲醇定容至200 μL, 经0.4 μm微孔滤膜过滤, 待测.

2 结果与讨论

2.1 回归方程的建立

分别取1.3中的标准品溶液各10.0 μL注入高效液相色谱仪(HPLC)中, 以峰面积积分值(y)为纵坐标, 5种拟除虫菊酯类农药混合标准品的进样质量浓度(x, mg/mL)为横坐标, 绘制标准曲线, 得到标准曲线方程. 氟氯氰菊酯的标准曲线方程为

y=41 635x-199.63,r=0.999 9；

七氟菊酯的标准曲线方程为

y=29 339x-34.20,r=0.999 9；

氯戊菊酯的标准曲线方程为

y=38 245x-217.86,r=0.999 9；

氯菊酯的标准曲线方程为

y=46 441x-182.47,r=0.999 9；

联苯菊酯的标准曲线方程为

y=46 616x+572.16,r=0.999 0.

2.2 单因素实验

2.2.1 洗脱剂的优化 用20 mg氧化石墨烯萃取25 mL花旗参茶饮料中的拟除虫菊酯类农药残留, 萃取时间设为20 min. 萃取结束后, 分别选择2 mL的纯溶剂甲醇、丙酮、乙腈、环己烷和混合溶剂V(丙酮)∶V(环己烷)=1为洗脱剂, 超声辅助洗脱拟除虫菊酯类农药, 结果如图2所示. 由图2可见: 甲醇对氧化石墨烯吸附的5种拟除虫菊酯类农药的洗脱效果最差； 与环己烷相比， 乙腈对氟氯氰菊酯、氯戊菊酯和氯菊酯的洗脱效果好, 对七氟菊酯和联苯菊酯的洗脱效果差; 与纯溶剂丙酮和环己烷相比， 混合溶剂V(丙酮)∶V(环己烷)=1对5种拟除虫菊酯类农药的洗脱效果较好. 综上可见，V(丙酮)∶V(环己烷)=1的洗脱效果最好, 即5种拟除虫菊酯类农药的回收率最高, 因此将V(丙酮)∶V(环己烷)=1作为洗脱剂.

2.2.2 洗脱体积的优化 以V(丙酮)∶V(环己烷)=1为洗脱剂, 其他条件不变, 分别选择2,3,5,8，10 mL洗脱剂超声辅助洗脱, 结果如图3所示. 由图3可见, 当洗脱体积为8 mL时, 洗脱效果最优, 此时5种拟除虫菊酯类农药的回收率最高, 因此将洗脱剂的体积定为8 mL.

a. 氟氯氰菊酯； b. 七氟菊酯； c. 氯戊菊酯； d. 氯菊酯； e. 联苯菊酯.图2 不同洗脱剂对5种拟除虫菊酯类农药残留提取回收率的影响Fig.2 Effect of different eluents on extraction recovery rate of five pyrethriod pesticide residues

a. 氟氯氰菊酯； b. 七氟菊酯； c. 氯戊菊酯； d. 氯菊酯； e. 联苯菊酯.图3 不同洗脱剂体积对5种拟除虫菊酯类农药残留提取回收率的影响Fig.3 Effect of different eluent volumes on extraction recovery rate of five pyrethriod pesticide residues

2.2.3 氧化石墨烯用量的优化 以V(丙酮)∶V(环己烷)=1为洗脱剂, 洗脱体积为8 mL, 其他条件不变, 分别用2,5,10,15,20 mg氧化石墨烯进行萃取, 考察氧化石墨烯用量对回收率的影响, 结果如图4所示. 由图4可见, 在2～20 mg内, 随着氧化石墨烯用量的增加, 5种拟除虫菊酯类农药的吸附效果降低. 主要原因为氧化石墨烯为单层氧化石墨烯粉末, 密度小, 加入的石墨烯质量越大, 越易对已洗脱并溶于洗脱剂中的拟除虫菊酯类农药进行二次吸附, 使其吸附效果变差, 导致回收率降低. 因此选择石墨烯的用量为2 mg.

2.2.4 萃取时间的优化 采用2 mg氧化石墨烯萃取25 mL花旗参茶饮料中的拟除虫菊酯类农药, 以V(丙酮)∶V(环己烷)=1为洗脱剂, 洗脱体积为8 mL, 选择萃取时间分别为10,20,30,40,50 min, 结果如图5所示. 由图5可见, 氧化石墨烯对5种拟除虫菊酯类农药的吸附效果随萃取时间的增加而降低. 当萃取时间为10～20 min时, 随着萃取时间的增加, 氧化石墨烯对饮料中氯戊菊酯和氯菊酯的吸附效果略有增加, 对氟氯氰菊酯、七氟菊酯和联苯菊酯的吸附效果略有降低； 当萃取时间为20～50 min时, 5种拟除虫菊酯的回收率均下降. 这是由于花旗参茶饮料中含有大量的葡萄糖等物质, 氧化石墨烯的吸附没有选择性, 随着萃取时间的增加, 氧化石墨烯会对其他物质进行吸附, 影响了其对拟除虫菊酯类农药的吸附, 导致5种拟除虫菊酯的回收率下降. 因此选择萃取时间为20 min.

a. 氟氯氰菊酯； b. 七氟菊酯； c. 氯戊菊酯； d. 氯菊酯； e. 联苯菊酯.图4 氧化石墨烯用量对5种拟除虫菊酯类农药残留提取回收率的影响Fig.4 Effect of amount of oxide graphene on extraction recovery rate of five pyrethriod pesticide residues

a. 氟氯氰菊酯； b. 七氟菊酯； c. 氯戊菊酯； d. 氯菊酯； e. 联苯菊酯.图5 萃取时间对5种拟除虫菊酯类农药残留提取回收率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction recovery rate of five pyrethriod pesticide residues

2.3 正交实验

2.3.1 正交实验设计 采用正交实验研究石墨烯用量(A)、洗脱剂体积(B)、洗脱剂(C)和吸附时间(D)对5种拟除虫菊酯类农药残留洗脱效果的影响. 实验共设上述4个因素, 每个因素设3个水平, 选取L9(34)正交表进行正交实验, 实验结果列于表1, 其极差分析结果列于表2, 方差分析结果列于表3.

2.3.2 正交实验结果分析 由表1～表3可见:

1) 氟氯氰菊酯的回收率受氧化石墨烯用量影响最大, 洗脱剂种类和洗脱剂体积次之, 受吸附时间影响最小, 即A>C>B>D, 由R值可知最优水平为A1B2C2D3； 氧化石墨烯用量对氟氯氰菊酯回收率的影响极其显著, 洗脱剂对其影响显著, 洗脱剂和吸附时间对其影响不显著.

2) 七氟菊酯的回收率受洗脱剂体积影响最大, 石墨烯用量和洗脱剂种类次之, 受吸附时间影响最小, 即C>A>B>D, 由R值可知最优水平为A1B3C2D2； 洗脱剂对七氟菊酯回收率的影响显著, 氧化石墨烯用量、洗脱剂体积和吸附时间对七氟菊酯回收率的影响不显著.

3) 氯戊菊酯的回收率受氧化石墨烯用量影响最大, 洗脱剂种类和洗脱剂体积次之, 受吸附时间影响最小, 即A>C>B>D, 由R值可知最优水平为A1B3C2D2； 氧化石墨烯用量对氯戊菊酯回收率的影响极其显著, 洗脱剂对其影响显著, 洗脱剂体积和吸附时间对其影响不显著.

4) 氯菊酯的回收率受氧化石墨烯用量影响最大, 洗脱剂种类和洗脱剂体积次之, 受吸附时间影响最小, 即A>C>B>D, 由R值可知最优水平为A1B3C2D3； 氧化石墨烯用量和洗脱剂对氯菊酯回收率的影响极其显著, 洗脱剂体积对其影响显著, 吸附时间对其影响不显著.

5) 联苯菊酯的回收率受氧化石墨烯用量影响最大, 洗脱剂种类和洗脱剂体积次之, 受吸附时间影响最小, 即A>C>B>D, 由R值可知最优水平为A1B3C2D3； 氧化石墨烯用量对联苯菊酯回收率的影响极其显著, 洗脱剂对其影响显著, 洗脱剂和吸附时间对其影响不显著.

表1 正交实验结果

表2 5种拟除虫菊酯类农药残留回收率的极差分析†

†k1,k2,k3为各水平的平均值.

表3 5种拟除虫菊酯类农药残留回收率的方差分析†

† **表示影响极其显著； *表示影响显著； 未标志表示影响不显著.

综上, 本文以氧化石墨烯材料为固相萃取的吸附剂, 研究了其对5种拟除虫菊酯类农药的萃取性能, 建立了一种液体样品前处理方法. 通过对影响固相萃取实验参数(氧化石墨烯用量、洗脱剂、洗脱剂体积和萃取时间等)的考察, 得到了最优萃取条件. 在最优萃取条件下, 加标回收率为65.93%～105.17%, 回收率(RSD)为0.66%～1.90%. 实验结果表明, 该方法简单、快速、高效, 可用于其他液体样品中拟除虫菊酯类农药残留的富集和检测.