李世根 樊向华

参芪补虚合剂是由党参、黄芪、泽兰、炙甘草、当归等药材组成，具有益气养血补虚、化瘀生新的功效，用于治疗妇女产后气血亏虚，夹有淤血阻滞所致头晕，神疲乏力，小腹隐痛等症。原方汤剂内服具有良好的临床疗效，但汤剂存在服用量大、味苦、携带不便、不宜大量制备等缺点。拟将本方改进制成合剂，具有使用方便、疗效佳、口感好、制备方法简单等优点，同时保持了汤剂原有的疗效。通过对文献资料的查阅研究，确定本方中与功效主治相关的成分主要为挥发油和水提液，结合临床应用现状、中药制剂技术及生产设备条件，本实验对挥发油提取工艺、水提工艺、浓缩工艺、成型工艺等进行了研究，最终确定参芪补虚合剂的最佳制备工艺，为该制剂的生产、临床使用提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪；Alltech 3300蒸发光散射检测器；DZTW型电子调温电热套(邦西仪器科技有限公司)；KW-1000DC HH系列数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)；Heidolph旋转蒸发仪；Mettler-Toledo XS205DU型电子分析天平；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与试药

党参、黄芪、当归等药材均购自广东康圣药业有限公司，经鉴定，均符合《中国药典》2015年版一部相关项下要求，黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号分别为110781-200713、111920-201102)均购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取

经预试，当归等含油药材所得挥发油比重<1.0，故参照《中国药典》2015年版四部2204项下挥发油测定法甲法提取挥发油。以挥发油提取率为考察指标，采用单因素试验法考察浸泡时间、加水倍数和提取时间对挥发油提取工艺的影响。

2.1.1 浸泡时间考察 按处方比例，称取当归等含油药材3份，每份383 g，加入8倍量水，分别浸泡0、1、2 h，蒸馏提取8 h，测定挥发油提取量并计算其提取率，结果见表1。结果表明：浸泡时间对挥发油的提取无明显影响，故提取挥发油时无需浸泡。

表1 浸泡时间对挥发油提取的影响

2.1.2 加水倍数考察 按处方比例，称取当归等含油药材4份，每份383 g，分别加入6、8、10、12倍量水，蒸馏提取8 h，测定挥发油提取量并计算其提取率，结果见表2。结果表明：当加水倍数达8倍量后，挥发油提取量随着加水倍数的增加变化不明显，因此加水倍数确定为8倍。

表2 加水倍数对挥发油提取的影响

2.1.3 提取时间考察 按处方比例，称取当归等含油药材3份，每份383 g，分别加入8倍量水，提取挥发油，记录不同时间挥发油的累积提取量，结果见表3。结果表明：当提取时间达6 h时，挥发油已基本提取完全，因此提取时间确定为6 h。

表3 提取时间对挥发油提取的影响

2.1.4 挥发油提取工艺验证试验 按处方比例，称取当归等含油药材3份，每份383 g，分别加入8倍量水，蒸馏提取6 h，测定挥发油提取量并计算其提取率，结果见表4。结果表明：挥发油的平均提取率为0.137%，与单因素试验的结果相近，表明优选的工艺稳定可行。

2.2 干膏率的测定

精密吸取各样品浓缩液50 mL，置干燥的蒸发皿中，照浸出物测定法(《中国药典》2015年版四部中药浸出物测定法)测定，称定干膏重量，并计算干膏率。计算公式：干膏率(%)=(W1×250)/(50×W2)×100% 。 注：W1为50 mL浓缩液中干膏重量，W2为药材重量。

2.3 指标成分的含量测定

2.3.1 色谱条件 黄芪甲苷：AichromBond-SB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-水(32 ∶68)；柱温35 ℃；流速1.0 mL·min-1；ELSD蒸发光散射检测器检测，氮气流速1.5 L·min-1，漂移管温度40 ℃。毛蕊异黄酮葡萄糖苷：Waters Xbridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.2%甲酸(11 ∶89)；柱温25 ℃；流速1 mL·min-1；检测波长260 nm。色谱图见图1。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品适量，加甲醇分别制成浓度为52.192 μg·mL-1的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液和0.503 3 mg·mL-1的黄芪甲苷对照品溶液，摇匀即得。

2.3.3 线性关系考察 分别精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液1、2、3、5、6、7 μL和黄芪甲苷对照品溶液2、4、6、12、16、20 μL，按照上述色谱条件进样，测得峰面积。毛蕊异黄酮葡萄糖苷以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得标准曲线的回归方程为Y=3.242 7X-49.723，相关系数r=0.999 4，表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷在52.192～365.34 ng之间线性关系良好。黄芪甲苷以进样量的对数值(X)为横坐标，峰面积对数值(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=1.624 7X+4.755 3，r=0.999 5，表明黄芪甲苷进样量在1.006 6～10.06 6 μg范围内自然对数值与峰面积自然对数值呈良好的线性关系。

2.3.4 供试品溶液的制备 精密移取各提取浓缩液1 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇超声处理(功率300 W，频率40 kHz)15 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液过微孔滤膜，即得毛蕊异黄酮葡萄糖苷供试品溶液。精密移取各提取浓缩液25 mL，照2015版《中国药典》一部黄芪项下供试品的制备方法制备最终转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得黄芪甲苷供试品溶液。

注：A，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品；B，毛蕊异黄酮葡萄糖苷阴性样品；C，毛蕊异黄酮葡萄糖苷供试品；D，黄芪甲苷对照品；E，黄芪甲苷阴性样品；F，黄芪甲苷供试品

图1参芪补虚合剂高效液相色谱图

2.3.5 阴性样品溶液的制备 按处方比例，称取除黄芪药材外的各味药材，分别加8倍水，煎煮2次，每次2 h，常压浓缩至约250 mL，按2.3.4项下方法制备阴性对照溶液。

2.4 水提工艺优选

选择加水量、提取时间、提取次数为考察因素，以黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量和干膏率的综合评分值为指标，加权系数分别为0.3、0.3、0.4。按处方比例称取党参、黄芪、白术等药材9份，每份484 g，按L9(34)正交表进行提取，滤过，滤液合并，常压浓缩并定容至250 mL。试验安排及结果见表5，方差分析见表6。由直观分析可知，各因素对水提工艺的影响顺序为提取次数(C)>加水量(A)>提取时间(B)，因素C(提取次数)对试验结果有显著的影响，因素A(加水量)有一定影响，因素B(提取时间)对试验结果无明显影响。综合考虑，确定最佳的工艺条件为：药材加8倍量水提取两次，第一次提取1.5 h，第二次提取1 h。

2.5 验证试验

按处方比例称取党参、黄芪、白术等药材，每份484 g。当归等提油药材加8倍量水，加热回流提取6 h，收集挥发油，药液保留，药渣与党参等其他药材按最佳工艺条件进行提取，滤过，滤液与提油的药液合并，浓缩并定容至250 mL。计算干膏率、黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量及综合评分值。结果见表7。结果表明验证试验的平均综合评分值为90.54，与正交试验综合评分值最大值相差不大，表明优选的工艺参数稳定可行。

表5 参芪补虚合剂水提工艺正交试验结果

表6 方差分析表

表7 最佳提取工艺验证结果

2.6 浓缩工艺考察

准确量取按提取验证工艺条件制备的提取液4份(黄芪甲苷含量为1.72 μg·g-1，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为6.51 μg·g-1)，每份10 kg，2份置旋转蒸发仪中减压浓缩(浓缩条件为：-0.085 Mpa; 55～75 ℃)至相对密度为1.10，另外2份常压浓缩至相对密度为1.10，测定浓缩液的重量及黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，并计算浓缩过程黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的保留率。结果见表8。结果表明提取液采用常压浓缩或减压浓缩，其黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的总含量和保留率差别不大，因此生产中可根据实际情况选用常压浓缩或减压浓缩。

表8 浓缩工艺研究结果

2.7 成型工艺考察

2.7.1 增溶剂的用量考察 挥发油不溶于水，制备中需加入适量的增溶剂使其能均匀分散在药液中，聚山梨酯80是常用的增溶剂，是药典中收载的可作为增溶剂和乳化剂的药用辅料，其HLB值为15，具有无毒、无刺激性的特点。因此，本品选择聚山梨酯80作为增溶剂。试验取含挥发油的蒸馏液100 mL，搅拌下逐步加入聚山梨酯80，直至上部挥发油滴均匀分散为止，结果折算成制剂每1 000 mL中，加入聚山梨酯80的量为5.3 g。

2.7.2 抑菌剂的使用 为保证合剂的稳定性，防止微生物生长，应加适量的抑菌剂，本品药液pH值在为5.12，因羟苯乙酯在酸性溶液中防腐作用强，选择羟苯乙酯作为抑菌剂，参照《中国药典》2015版四部0181合剂项下防腐剂的用量要求，确定本品一个制剂单位中羟苯乙酯用量为0.5 g。

2.7.3 矫味剂的使用 本方制成合剂后口感有酸涩，且有苦味，需要加入适当的甜味剂矫味，以满足临床的使用，本品选择具有药典标准的蔗糖作为甜味剂。以药液口感为指标，取按优选工艺提取的浓缩液900 mL，加入羟苯乙酯0.5 g，加热保温30 min，放冷，冷藏静置24 h，滤过，滤液加入用聚山梨酯80溶解的芳香水溶液100 mL，加纯化水至1 000 mL，混匀，逐渐加入蔗糖，观察药液外观并用口尝之。结果显示当蔗糖加入量为28 g时，即蔗糖加入量为制成量的2.8%时，合剂味甜，无苦涩味，口感得到改善，确定本品蔗糖用量为2.8%。结果见表9。

表9 矫味剂用量的考察

3 讨论

当归等药材含有挥发油，现代药理研究表明，所含挥发油具有调节免疫功能的作用，还能止痛，促进细胞的增殖[1-2]，因此，应将有效成分挥发油提取出来。而其他的水溶性成分也具有改善血液循环、促进造血干细胞的增殖和分化等作用[3-4]，可用于治疗妇女产后气血亏虚的症状，故将提油后的药渣与其他药材再进行水煎煮。党参、黄芪等其他药材的主要有效成分为水溶性成分[5-6]，故采用水提取。黄芪在本方中起补中益气的作用。经预试，黄芪中的主要成分黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法成熟，且文献报道中常对其进行含量测定以作为评价指标[7-9]，故本方选择黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量作为提取工艺的监测指标。

为保证制剂的质量和稳定，需在制剂中加入适量抑菌剂。pH对抑菌剂的抑菌效力影响很大，常用的抑菌剂苯甲酸钠防腐能力较强的pH值是在4以下，而羟苯乙酯的适用pH值则相对较广，因此选择抑菌剂时要严格考虑药液的pH值。本实验对处方药液的pH值进行监测，发现药液的pH值在5左右保持稳定，考虑到羟苯乙酯的化学性质稳定，其抑菌效力在酸性溶液中作用最强，而在微碱性环境中作用减弱，故本制剂选择羟苯乙酯作用本品的抑菌剂，以防止微生物生长，保证制剂的安全。