程洪兵，李寒冰，张跃文，赵永旗*，韩石蕊，邵海荣，郭社民

（1.濮阳市人民医院，河南 濮阳 457000；2.河南中医药大学，郑州 450046；3.濮阳市食品药品检验检测中心，河南 濮阳 457000）

八味大青叶洗剂是本院应用多年的协定处方制剂，由大青叶、蛇床子、苦参、地肤子等8味中药经水提、醇提、浓缩等工艺制备而成的外用洗剂，八味大青叶洗剂可发挥清热及解毒、燥湿和止痒的作用。为更好地控制药品质量，采用薄层色谱鉴别（TLC）[1]补充并改进了本制剂中大青叶、苦参、地肤子、金银花等4味药材的定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）[1]对君药蛇床子中所含蛇床子素进行了含量测定研究，实验结果表明，本方法操作简便可靠，灵敏度高，可有效控制八味大青叶洗剂的质量。

1　材料

Waters 515高效液相色谱仪；Precisa电子天平（型号：92SM-202A）；紫外可见分光光度计（型号：L6）；三用紫外仪（型号：ZF-2）；硅胶G薄层板（10 cm×20 cm，北京恒业中远化工有限公司）；2%氢氧化钠溶液-硅胶G薄层板（10 cm×20 cm，自制）；聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。大青叶的对照药材、苦参的对照药材、金银花的对照药材、地肤子皂苷Ic的对照品、蛇床子素对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号分别为：121367-200401，121019-200304，121060-200504，111723-200602，110822-200406）；八味大青叶洗剂（批号分别为170306，170328，170410，170421）及阴性样品均由濮阳市人民医院制剂室提供；甲醇、乙腈为色谱纯；苯、甲苯、醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙酸、乙醇、无水乙醇、氢氧化钠、碘化铋钾、浓氨水、亚硝酸钠等均为分析纯；薄层层析硅胶G（60型，中国青岛海洋化工集团公司）为化学纯；水为注射用水。

2　方法与结果

2.1定性鉴别[2-8]

2.1.1大青叶薄层色谱鉴别 取本品10 mL，加1%盐酸调pH值至2～3，置分液漏斗中，加三氯甲烷振摇提取3次，每次提取10 mL，将三氯甲烷液进行合并，之后挥干，对剩余的残渣加入1 mL的三氯甲烷，使残渣溶解，将其作为供试品的溶液。对缺大青叶的相关阴性样品、阴性的对照溶液进行制备。并取大青叶的对照药材共1.2 g，加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，给予滤过，将滤液进行浓缩到1 mL，将其作为对照的药材溶液。对以上3种溶液均分别吸取10 μL，点在同一个硅胶G薄层板的上面，将苯-三氯甲烷-丙酮（5：4：1）作为展开剂，展开并晾干之后，于日光下进行检视。供试品的相关色谱中，在和对照药材的色谱所对应的位置上，显出相同颜色的相关斑点，阴性的对照溶液则没有出现相关斑点，见图1A（插页二）。

2.1.2苦参薄层色谱的鉴别 取得10 mL的本品，加入浓氨试液调节其pH值到碱性，加入三氯甲烷进行振摇并进行3次提取，每次加入10 mL，将三氯甲烷液进行合并，之后挥干，对剩余的残渣加入0.5 mL的三氯甲烷，使残渣溶解，将其作为供试品的溶液。对缺苦参的相关阴性样品、阴性的对照溶液进行制备。并取苦参的对照药材的粉末共1.2 g，加入25 mL的三氯甲烷、0.3 mL的浓氨试液，于超声下30 min，给予滤过，将滤液进行挥干，剩余的残渣加入0.5 mL三氯甲烷，使残渣溶解，将其作为对照的药材溶液。对以上3种溶液均分别吸取10 μL，点在同一个2%的氢氧化钠溶液-硅胶G薄层板的上面，将苯-丙酮-甲醇（8：3：0.5）作为展开剂，展开并晾干之后，将甲苯-醋酸乙酯-甲醇-水（2：4：2：1）在低于10℃放置之后的上层溶液作为展开剂，展开并晾干之后，喷上碘化铋钾试液以及亚硝酸钠乙醇试液。在供试品的色谱中，在和对照药材的色谱所对应的位置上，显出相同颜色的相关斑点，阴性的对照溶液则没有出现相关斑点，见图1B（插页二）。

2.1.3地肤子薄层色谱的鉴别 取得本品共20 mL，加丙酮30 mL振摇，过滤，收集续滤液备用；取续滤液15 mL，置水浴蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。按样品的制备工艺制备缺地肤子的阴性的样品，并对阴性的对照溶液进行指标。取地肤子皂苷Ic的对照品，加入甲醇制备每l mL含有0.5 mg的溶液，将其作为对照品的溶液。对以上3种溶液均分别吸取5 μL，点在同一个硅胶G薄层板的上面，将三氯甲烷-甲醇-水（16：9：2）作为展开剂，展开并晾干之后，喷上10%的硫酸乙醇溶液，使用热风吹到斑点的显色比较清晰。供试品的色谱中，在和对照品的色谱所对应的位置上，显出相同的紫红色的斑点，阴性的对照溶液则没有出现相关斑点，见图1C（插页二）。

2.1.4金银花薄层色谱鉴别 取2.1.3项续滤液5 mL，置水浴蒸干，残渣加入2 mL的甲醇使之得到溶解，将其作为供试品的溶液。对缺金银花的阴性样品、阴性的对照溶液进行制备。取得金银花的对照药材共0.2 g，加入5 mL的甲醇，给予30 min超声处理，给予滤过，将滤液作为对照的药材溶液。对以上3种溶液均分别吸取10 μL，点在同一个聚酰胺薄膜的上面，使用42%的乙酸溶液作为展开剂，展开并晾干之后，放于紫外光灯（365 nm）下面进行检视。供试品的色谱中，在和对照药材的色谱所对应的位置上，显出相同的颜色的相关荧光斑点，阴性的对照溶液则没有出现相关斑点，见图1D（插页二）。

2.2蛇床子素含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：WelchromC18色谱柱（ 250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相为：乙腈-水（比例为65：35）；检测波长322 nm；流速为1.0 mL/min；理论板数按蛇床子素计算应不低于3 000。在该条件下测定，阴性对照无干扰，见图2（插页二）。

2.2.2溶液的制备 取适量的蛇床子素的对照品，加如乙醇制备每1 mL含有1402.0 µg的溶液，作为储备液。取储备溶液1 mL置10 mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密的量取5 mL的八味大青叶洗剂，放在50 mL的量瓶内，加入无水乙醇到刻度，给予摇匀和滤过，得到供试品的溶液 。将相同比例的处方内不含有蛇床子的其它药材进行阴性样品的制备，并对阴性的对照溶液进行制备。

2.2.3线性关系的相关考察 准确量取对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。吸取20 µL注入液相色谱仪，按2.2.1项下色谱条件测定峰面积。以蛇床子素面积积分值（Y）为纵坐标，蛇床子素进样浓度（X，µg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y＝39 439 X＋148 877 ，r = 0.999 8（n = 6）。结果表明，蛇床子素进样浓度在56～280 µg/mL范围之内，浓度和峰面积显示比较良好的线性关系。

2.2.4精密度以及稳定性的试验 准确量取同一个对照品的溶液20 µL，按2.2.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。以峰面积计算，RSD为 0.95%（n = 6），表明方法精密度良好。室温放置，于0，1，2，4，8，12 h分别进样，记录峰面积基本不变，RSD为0.98%，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

2.2.5重复性实验 分别精密量取八味大青叶洗剂（批号170328）6份，按2.2.2项下方法制备供试品的溶液且进行进样，对峰面积进行测定，对样品中的蛇床子素的平均含量进行计算得到的值为1 624.8 µg/mL，RSD为1.10%（n = 6），表明方法重复性良好。

2.2.6加样回收率试验 精密量取八味大青叶洗剂（批号170328，蛇床子素浓度1 624.8 µg/mL）6.0，4.0，2.0 mL三个梯度各2份，分别置100 mL量瓶中；再分别对应依次精密加入蛇床子素对照品储备液（1 402.0 µg/mL）4.0，8.0，12.0 mL各2份置上述100 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，制得六份供试溶液。取供试溶液各20 µL，依次注入液相色谱仪，按2.2.1 项下色谱条件 测定蛇床子素含量，计算回收率。供试溶液中的蛇床子素含量以浓度单位表示，结果见表1。

2.2.7样品含量测定 取3批供试品（批号：170306，170410，170421），依照2.2.2项下方法制备3份供试品的溶液，根据2.2.1中的色谱条件进行进样，对峰面积进行记录，根据外标法进行含量计算，所得到的结果如表2。

表1　蛇床子素回收率实验结果

表2　八味大青叶洗剂中的蛇床子素的含量的测定结果

3　讨论

八味大青叶洗剂中除了含有以上检测的5种药材外，还含有苍术、莱菔子、紫花地丁等3种药材。本制剂原质量标准中仅有大青叶和苦参的薄层鉴别项，现增加了地肤子、金银花的薄层鉴别项，完善了大青叶、苦参的薄层鉴别。金银花薄层鉴别中，曾选用硅胶G的薄层板、硅胶H的薄层板和乙酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）的上层溶液作为展开剂的试验，效果均不理想；考虑到金银花中含有较多的黄酮类如木樨草黄素、有机酸类如绿原酸、挥发油类如芳樟醇等[9]，而聚酰胺薄膜分离上述化学成分有较好的效果，故选用聚酰胺薄膜，以乙酸为展开剂进行展开，并对比试验了乙酸的3种不同浓度（42%，36%，30%），结果显示，选用42%乙酸分离效果最理想，且斑点清晰。八味大青叶洗剂之君药蛇床子，为伞形科植物蛇床的干燥成熟果实，味辛、苦、温，具有温肾壮阳，燥湿，祛风，杀虫等作用。蛇床子含有香豆素类化合物如蛇床子素、欧前胡脑等和挥发油如蒎烯、异戊酸龙脑酯等[10]，《中国药典》2015年版1部对蛇床子中蛇床子素的含量进行了规定。本制剂原质量标准无含量测定项，现选择蛇床子中含量较高的蛇床子素作为含量控制项，能侧面反映本制剂的制备状况，有助于控制制剂质量。配制蛇床子素对照品溶液，作紫外光谱扫描，在322 nm处有最大吸收，故选取322 nm为检测波长。参考文献报道[11-15]笔者对本制剂供试品制备、流动相选择、检验方法学等方面做了系列研究，结果为文中所述条件最优，结果理想。根据八味大青叶洗剂本次含量测定的结果及平时实际配制的测定情况，确定八味大青叶洗剂中所含蛇床子素每1 mL不得少于1.0 mg。为更好控制药品质量，今后有待进一步开展八味大青叶洗剂中，其他药材薄层色谱鉴别及有效成分含量测定等方面的方法学研究。