孙超,齐文静,张蒙爱,张彭,刘振宇,张星耀

(1.山东农业大学植物保护学院,山东 泰安　271000; 2.南京林业大学南方现代林业协同创新中心,江苏 南京　210037;3.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,北京　100091)

松材线虫Bursaphelenchusxylophilus(Steineret Buhrer) Nickle是我国重要外来入侵有害生物,由其侵染引起的松材线虫病是世界性病害,具有发病迅速、致死率高、防治困难等特征,一旦传入,造成松林大面积死亡[1-2]。该病于1905年在日本首次发现,目前主要分布在中国、日本、韩国、墨西哥、葡萄牙、加拿大、美国等国家[1-6];我国大陆自1982年传入以来,逐步在我国有松林地区扩散,至2017年,江苏、浙江、江西、山东、安徽、福建、河南、湖南、湖北、广东、广西、重庆、贵州、四川、陕西、辽宁等16个省的多个区县都被列为松材线虫病疫区[7];严重威胁林业生产,破坏森林生态平衡,造成巨大经济损失。

松材线虫是一种迁移性寄生线虫,其运动行为是传播致病的基础。松材线虫的生活史可以分为繁殖型周期和扩散型周期[8-9],线虫在松树个体之间的传播依靠扩散型幼虫。春季在松墨天牛羽化前,松材线虫扩散型Ⅲ龄幼虫向媒介天牛蛹室周围运动聚集,以Ⅳ龄幼虫状态由天牛气孔进入呼吸系统[10-11],并随着媒介天牛补充营养或产卵时传播至健康松树并快速繁殖和致病[4]。另外,关于松材线虫的致病机制一直是松材线虫病研究的核心和重点,目前主要有毒素学说、空洞化学说、酶学说以及细菌学说[12-14]。有研究认为,松材线虫的运动与松树空洞化有着密切的联系。线虫进入树体后沿松树皮层和木质部的树脂道运动扩散,快速加剧松树木质部管胞空洞化,对水分运输途径形成毁灭性破坏[15-17]。因此,研究松材线虫运动行为对探明其迁移运动、传播扩散及致病机制具有十分重要意义。

运动是一种神经行为,乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)作为线虫的一种重要神经递质,常见于中枢及周边神经系统中,参与自主神经系统及体运动神经系统的神经传导,调节肌肉活动[18-19]。乙酰胆碱酯酶(acetylchlinesterase,AChE,EC3.1.1.7)能在胆碱神经突触处快速催化水解乙酰胆碱变为乙酸和胆碱,从而终止神经冲动的传递。作者通过药物干预神经递质乙酰胆碱,探究松材线虫受干扰后运动行为的异常特征,以期为进一步研究松材线虫的运动行为及其所产生的松材线虫病迁移扩散机制和致病机理研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1松材线虫虫株与菌株 灰葡萄孢Botrytiscinerea和松材线虫虫株NXY61为中国林业科学研究院张星耀实验室保存菌株与虫株。虫株NXY61,分离自浙江宁波马尾松松材线虫病木,以在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长的灰葡萄孢菌为食,于25 ℃恒温培养箱中培养,4 ℃环境中长期保存。

1.2供试药品硫酸阿托品是抗胆碱药物,阻滞乙酰胆碱与受体结合;甲硫酸新斯的明是抗胆碱酯酶药物,抑制乙酰胆碱酯酶活性,减缓乙酰胆碱水解造成递质堆积;均购自国内试剂公司。

1.3松材线虫的培养与分离将灰葡萄孢菌接种于PDA培养基上,25 ℃恒温培养箱内培养5 d左右,待菌丝长满培养皿后接入松材线虫,25 ℃恒温培养4～5 d,采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫。将分离出的松材线虫收集到4 mL离心管中,用无菌水清洗2～3遍,用于药物处理。

1.4硫酸阿托品对松材线虫运动的影响向密度约为3 000头/mL的1 mL松材线虫水悬液内加入浓度为0.5 mg/mL的硫酸阿托品液1 mL,未加药物处理作为对照;在处理10,30 min,及1,3,6,12,24 h等7个时间点,取线虫液于凹玻片凹穴中,观察线虫的行为特征,统计1 min时长的松材线虫头部摆动频率、身体弯曲频率,每次统计10头线虫,并观察线虫运动形态异常率,统计50头线虫。按照刘宝军的定义[20],线虫头部弯曲至身体长度的1/4时定义为一次头部摆动,1 min内头部摆动次数为头部摆动频率;假定沿着咽泵的方向为y轴,那么线虫爬行过程中,身体沿着相应x轴方向上的1次改变则定义为一个身体弯曲,1 min内身体弯曲次数为身体弯曲频率。

1.5甲硫酸新斯的明对松材线虫运动的影响向密度约为3 000头/mL的1 mL松材线虫水悬液内加入浓度为1 mg/mL的甲硫酸新斯的明液1 mL,未加药物处理作为对照。松材线虫头部摆动频率、身体弯曲频率、运动形态异常率的观察统计方法同1.4。

2　结果与分析

2.1硫酸阿托品作用下松材线虫的运动形态异常未用药物处理的松材线虫在水中表现为明显的泳动状态,头部左右摆动,躯体随头部摆动和身体肌肉作用而呈舒展的S形前行运动,运动流畅(图1)。

a.3龄幼虫；b.成虫图1　松材线虫正常S形运动状态

用抗胆碱药硫酸阿托品阻滞松材线虫乙酰胆碱与受体结合,松材线虫活动整体变缓慢,泳动速度降低,身体出现不正常扭动;随着药物处理时间延长,线虫运动形态发生明显异常,由S形变化为多节弯曲(图2a,b,c),甚至呈螺旋状卷曲(图2d,e,f);各龄期幼虫和雌雄成虫均出现类似的运动异常现象与规律性。

硫酸阿托品处理后,松材线虫2龄幼虫对药物敏感,最先表现出运动形态异常,成虫出现时间稍晚。在药物处理10 min到12 h内,2龄幼虫异常率一直最高,3龄幼虫次之,4龄幼虫和雌雄成虫之间的异常率差异不大;各虫态表现运动形态异常的线虫数量随着药物处理时间延长而增加,24 h时,所有虫态线虫的运动形态异常达到100%(图3)。

a-c.异常多节弯曲(a.4龄幼虫，b.雌成虫，c.雄成虫)；d-f.异常螺旋状卷曲(d.4龄幼虫，e.雌成虫，f.雄成虫)图2　硫酸阿托品处理后松材线虫的运动形态异常特征

图3　硫酸阿托品处理不同时间后松材线虫运动形态异常率

2.2硫酸阿托品处理对松材线虫头部摆动频率和身体弯曲频率的影响硫酸阿托品处理后,松材线虫头部摆动频率和身体弯曲频率明显降低,且随着药物的持续作用,头部摆动和身体摆动受到抑制作用持续增强,摆动率持续下降,各龄幼虫和成虫摆动率下降规律基本一致(图4,5)。药物处理24 h后,2龄幼虫完全丧失了头部摆动的运动表现,3龄、4龄幼虫，雌、雄成虫的头部摆动频率比0 h的头部摆动频率分别下降91.8%，92.0%，84.3%，83.6%(图4)。各龄期线虫的身体弯曲频率也随抑制的持续作用而不断下降,规律基本一致。药物处理24 h后,2龄幼虫仍具有身体弯曲现象,但比0 h身体弯曲频率下降92.9%,3龄、4龄幼虫，雌、雄成虫的身体弯曲频率比0 h的线虫身体弯曲频率分别下降74.5%，80.0%，80.0%，76.2%(图5)。

图4　硫酸阿托品处理不同时间后松材线虫头部摆动频率变化

图5　硫酸阿托品处理不同时间后松材线虫身体弯曲频率变化

2.3甲硫酸新斯的明处理松材线虫的运动形态的异常特征用抗胆碱酯酶药物甲硫酸新斯的明处理松材线虫后,在显微镜下观察到线虫总体运动形态依然呈现为S形,但摆动幅度较未经药物处理的线虫大,间歇性出现短暂的不规则扭动(图6a),有的线虫运动时身体呈C形弯曲(图6b),有的大程度弯曲成O形(图6c),甚至表现为卷曲成团再伸展开。整体上,药物处理后松材线虫泳动一次的速度较未经药物处理的线虫加快,图6所示松材线虫异常运动形态,在与图1相同的采照情况下,表现出因经药物处理后松材线虫泳动速度加快而出现的照片虚化特征,而未经药物处理的线虫则一直表现出正常的S形运动形态特征(图1a,b)。

a.异常状态的S形；b.异常状态的C形；c.异常状态的O形图6　甲硫酸新斯的明处理后松材线虫的运动形态

2.4甲硫酸新斯的明处理对松材线虫头部摆动频率和身体弯曲频率的影响药物处理24 h后,相比较0 h线虫头部摆动频率,2龄幼虫上升10.8%,3龄幼虫下降4.1%,4龄幼虫上升14.0%,雌成虫上升9.8%,雄成虫下降1.8%;身体弯曲频率与0 h线虫身体弯曲频率比较,2龄幼虫上升9.5%,3龄幼虫下降3.6%,4龄幼虫上升1.7%,雌成虫上升8.3%,雄成虫上升1.6%(图7,8)。可见,在统计数据上,松材线虫的头部摆动频率和身体弯曲频率变化趋势表现规律性不强,不同虫态线虫在不同时间点表现为运动频率的升与降不一致。但是,结合松材线虫经药物处理后的整体表现,甲硫酸新斯的明能够明显引起松材线虫头部摆动频率和身体弯曲频率的提高,鉴于其经药物处理后表现出间歇性、短暂性的不规则扭动特征,在统计时间点表现不同的频率数据,总体体现出甲硫酸新斯的明对松材线虫运动神经系统兴奋性作用。

图7　甲硫酸新斯的明处理不同时间后松材线虫头部摆动频率的变化

图8　甲硫酸新斯的明处理不同时间后松材线虫身体弯曲频率的变化

3　结论与讨论

本试验通过两个方向的途径,即两种药物干预神经递质乙酰胆碱的作用,来探究其对松材线虫运动行为产生的影响。途径一是利用抗胆碱药物硫酸阿托品阻滞递质不能与受体进行结合,可观察到线虫出现活动缓慢、头部摆动频率身体弯曲频率持续降低的运动异常现象,体态呈现螺旋卷曲或多节弯曲的特征;途径二是利用抗胆碱酯酶药物甲硫酸新斯的明抑制乙酰胆碱酯酶酶活,减缓乙酰胆碱水解造成神经递质堆积,可观察到线虫运动活性显著增强,身体摆动幅度加剧等特征表现。可见,用药物干预方式探讨松材线虫的运动性能够揭示松材线虫运动行为的特征。

松材线虫病是松材线虫、媒介昆虫、松树的多元复合病害系统,在病害系统中,松材线虫与媒介昆虫天牛之间的密切关系,是松材线虫病在松树树体之间扩散传播的重要基础。松材线虫在天牛羽化前向蛹室迁移聚集[10-11],改变松材线虫的运动性,也许能够改变松材线虫向媒介昆虫蛹室的聚集能力,在此方向上分析媒介昆虫与松材线虫的关系,也是一个可行的途径。科学家对松材线虫的致病机制给予了广泛关注,空洞化一直被视为重要的致病机制[14,17,21],作为迁移性线虫,松材线虫在松树树体内的迁移运动是否与松树的空洞化相关？松材线虫的高繁殖力一直被认为是松材线虫致病的重要因素,松材线虫在交配过程中有搜寻、接触、交尾等系列运动特征[20],松材线虫运动性与繁殖能力相关性、对致病的作用如何？这些问题,在本研究对松材线虫运动性抑制的分析基础上,也许可以进一步开展更多的研究探索。因此,本研究为进一步研究松材线虫行为异常对种群扩散传播的影响及致病机制研究提供了一个路径。当然,尽管本研究的目标并未瞄向杀虫剂药物靶标问题,但是乙酰胆碱酯酶作为药物靶标的方式和机理一直是农药开发和药理学研究的主要内容重点,同样一些杀线剂的作用靶标也是乙酰胆碱酯酶[19,22],因此,本研究或可为将乙酰胆碱酯酶作为药物靶标影响松材线虫运动性,进而起到防治松材线虫病的目的提供思路。