李海燕 孙 静 杨亚娟 张逍港

(西安医学院医学技术系，陕西 西安 710000)

肝纤维化是肝脏组织在各种病因的损伤下发生的一种可逆的损伤修复反应，以细胞外基质(ECM)过度沉积为特点，肝星状细胞(HSC)是ECM的主要来源。若肝纤维化得不到有效控制，最终会进展为肝硬化。在我国，乙肝病毒(HBV)感染是导致肝炎、肝硬化的主要病因。研究表明〔1，2〕，HBV编码的X(HBx)蛋白在肝纤维化的启动和发展中发挥了重要作用。NADPH 氧化酶(NOX)的多种亚基如NOX1、NOX2、NOX4，通过生成活性氧簇(ROS)介导了氧化应激反应，在HSC活化中发挥了重要作用〔3～5〕。转化生长因子(TGF)-β1在各种类型的肝纤维化中，是最强的致纤维化的细胞因子。为证实HBx蛋白是否能够活化HSC及通过何种分子活化HSC，本研究将HBx-pcDNA3.1转染入L02肝细胞株，构建稳定转染HBx的L02-HBx细胞株，随后制备L02-HBx、LX-2/L02-pcDNA3.1、 LX-2/L02的条件培养基，分别孵育HSC株LX-2。检测HSC活化标志物α-SMA、TGF-β1和NOX4的蛋白表达，进一步揭示其分子机制，探讨HBx蛋白对HSC的活化和NOX分子表达的影响及TGF-β1在这个过程中所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂 人HSC株LX-2、人肝细胞株L02由中科院上海细胞库提供；细胞孵育于培养基(由RPMI1640、10%小牛血清、100 mg/L链霉素、100 kU/L青霉素配制而成)，放置于5%CO2恒温培养箱(37℃)，实验取用对数生长期细胞。pcDNA3.1-HBx质粒(西安依科生物有限公司)、NOX4 siRNA(上海吉玛制药技术有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国 Pierce公司)、潮霉素B、SB-431542(Sigma公司，美国)、 TGF-β1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国 Peprotech公司 )、兔抗人NOX4抗体，鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、α-tubulin抗体(美国 Abcam公司)。

1.2HBx基因转染L02细胞株 ①按照LipofectamineTM2000脂质转染试剂盒说明书操作步骤，将pcDNA3.1-HBx质粒转染入对数生长期L02细胞，阴性对照组转染空pcDNA3.1质粒。②转染48 h，细胞以1∶10比例稀释后，重新铺24孔板。经适当浓度潮霉素B选择培养2 w，种至96孔板。③挑取较大单克隆，消化后扩大增殖至24孔板培养，最终扩大至6孔板培养，直至可进行Western印迹实验检测HBx蛋白表达，建立L02-HBx细胞株。

1.3ELISA检测L02-HBx细胞培养上清中TGF-β1的表达 收集L02-HBx、L02-pcDNA3.1(阴性对照组)、L02细胞株(空白对照组)24 h的培养基，离心，吸取上清液，严格按照Peprotech公司TGF-β1 ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm波长测量各孔吸光值。

1.4制备稳定转染HBx蛋白的肝细胞条件培养基 分别将三组细胞株以1×105密度接种于6孔板，待细胞培养至80%～90%融合度时更换为不含小牛血清的RPMI1640培养液，48 h后吸取培养基，离心后取上清液即为条件培养基。

1.5Western印迹检测条件培养基孵育的HSC中NOX4和α-SMA蛋白的表达 将LX-2细胞以1×105密度接种于6孔板，待细胞培养至80%～90%融合度时更换为不含小牛血清的RPMI1640培养液，饥饿24 h。再以上述制备的L02-HBx条件培养基作用于饥饿后的LX-2细胞，阴性对照组为L02-pcDNA3.1条件培养基，空白对照组为L02条件培养基。处理24 h后，以含有1/100苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA细胞裂解液溶解细胞，提取蛋白，并以BCA法定量。蛋白变性、上样，行SDS-PAGE电泳，恒压80 V，30 min后转恒压120 V 90 min，蛋白转PVDF膜，转膜75 min，封闭1 h，洗膜后分别与封闭液稀释的特异一抗于4℃孵育过夜，PBST洗膜30 min，二抗孵育，室温1 h，PBST洗20 min，化学发光法显影。实验平行重复3次。

1.6Western印迹检测NOX4敲减后HSC中α-SMA及NOX4蛋白表达 以NOX4 siRNA转染 L02-HBx条件培养基孵育的LX-2细胞，转染介质为LipofectamineTM2000脂质转染试剂盒，阴性对照组转染无关siRNA序列，空白对照组不加干扰序列。转染24 h后，提取上述3组细胞的总蛋白，进行Western印迹检测，方法同上。实验平行重复3次。

1.7Western印迹检测加入TGF-β1受体抑制剂后NOX4蛋白的表达 将L02-HBx条件培养基分为3组，分别为：10 μmol/L SB-431542处理组，PBS处理组，未加处理组。将以上3组条件培养基孵育LX-2细胞24 h后，提取上述3组细胞的总蛋白，进行Western印迹检测NOX4蛋白的表达，方法同上。实验平行重复3次。

1.8统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1肝细胞中HBx蛋白的表达 L02-HBx细胞中有相对分子质量17 kD的条带出现，而其余两组细胞中无此条带出现(图1)，说明L02-HBx细胞可以稳定表达HBx蛋白。

2.2L02-HBx细胞培养上清液中TGF-β1的表达 L02-HBx组、阴性对照组及空白对照组细胞培养上清液中TGF-β1的表达量分别为(2 913.55±579.82)、(209.40±69.36)、(230.57±55.76)pg/ml，L02-HBx细胞培养上清中TGF-β1的表达量显著高于其他两组(均P<0.01)。

2.3L02-HBx的条件培养基孵育HSC后，NOX4和α-SMA的蛋白表达 与L02-HBx共培养的LX-2细胞(LX-2/L02-HBx)中NOX4(179.98±20.96)和α-SMA蛋白(180.27±18.05)表达均显著高于阴性对照组(105.71±13.47，89.7±14.37)和空白对照组(111.8±24.82，93.66±18.42，P<0.01)，见图2。

2.4敲减NOX4后HSC中α-SMA蛋白的表达 LX-2/ L02-HBx+si-NOX4组中随着NOX4表达(125.78±12.04)的下调，α-SMA的表达(121.81±33.89)也显著低于阴性对照组(244.33±14.61，216.06±20.1)和空白对照组(242.04±25.28，221.46±27.34，P<0.05)，见图3。

2.5在L02-HBx的条件培养基中加入TGF-β1受体抑制剂后NOX4蛋白的表达 加入SB-431542的L02-HBx的条件培养基，孵育过的LX-2中NOX4蛋白表达(53.04±9.39)显著低于空白对照组(122.07±12.44，P<0.05)，见图4。

1.L02-HBx;2.阴性对照组;3.空白对照组图1 肝细胞中HBx蛋白的表达

1.LX-2/L02-HBx;2.阴性对照组;3.空白对照组图2 不同条件培养基孵育后，LX-2中NOX4和α-SMA蛋白的表达

1.LX-2/L02-HBx+si-NOX4;2.阴性对照组;3.空白对照组图3 敲减NOX4后HSC中α-SMA和NOX4蛋白的表达

1.LX-2/L02-HBx+ SB-431542;2.空白对照组图4 L02-HBx条件培养基中加入SB-431542后NOX4蛋白的表达

3 讨 论

HBV感染是慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的重要致病因素之一，但其发病机制尚未完全阐明。HBx蛋白由HBV DNA中一个最小的开放阅读框架编码而成，由154个氨基酸组成，是一个多功能的调节因子。研究认为HBx蛋白在肝细胞癌的发生发展中发挥了重要作用〔6〕，如：它可以通过调节肝癌细胞转录、干扰正常肝细胞修复、影响多种细胞信号通路等方式，从而调控肝癌细胞的生长、增殖、侵袭与转移。HSC是肝纤维化病理过程中ECM的主要细胞来源，它的活化在肝纤维化疾病进展中发挥重要作用。目前，很多研究者致力于HBV导致肝纤维化机制的研究，结果表明〔7，8〕，HBV可以通过多种途径启动HSC的活化，而HBx蛋白可以促进其增殖并使其在肝纤维化的病理过程中发挥作用，但HBx活化HSC的具体机制尚未完全阐明。以往研究显示〔9，10〕，NOX4在肝纤维化的大鼠模型中表达增加，尤其在HSC中的表达显著高于对照。Lan等〔5〕揭示NOX4通过介导多条细胞信号通路，诱导HSC的持续激活。但NOX4在乙肝相关的肝纤维化中是否对HSC的活化发挥重要作用尚未有文献报道。TGF-β1是公认的最强致纤维化的细胞因子，它诱导发生肝纤维化的主要机制有：促进ECM的合成及抑制其降解、直接激活HSC、诱导肝细胞通过EMT转变为成纤维细胞等〔11〕。但TGF-β1在乙肝相关的肝纤维化中是否调节NOX4的表达，进而影响HSC的活化尚需进一步实验证实。为了更好地模拟人感染HBV后，肝细胞与HSC所发生的病理生理过程，本课题的研究对象区别于以往国内外所使用的HepG2、 SMMC-7721等肝癌细胞株，以具有正常肝细胞形态功能的L02肝细胞株及人正常HSC株LX-2为研究对象，结果显示L02-HBx细胞条件培养基孵育的LX-2细胞中，α-SMA和NOX4的蛋白表达明显增高，TGF-β1在L02-HBx细胞条件培养基中的表达量也明显增高。因此课题组做出如下假设：表达了HBx蛋白的肝细胞可以通过旁分泌TGF-β1的方式上调NOX4，NOX4进一步促进HSC的活化，从而促进肝纤维化的发生。

本研究利用si-NOX4干扰了L02-HBx条件培养基孵育的LX-2细胞后，检测其表达及活化情况，结果表明随着NOX4蛋白表达的下调，HSC活化标志物α-SMA的表达也部分地下调，这表明在乙肝相关的肝纤维化中，NOX4与α-SMA的表达具有一定的相关性，NOX4在HSC的活化中发挥了一定作用，在L02-HBx细胞条件培养基中加入TGF-β1的受体阻断剂后，细胞中NOX4的表达显著降低。本研究属体外实验，故而其结论有待进一步的动物实验进一步加以验证。

4 参考文献

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