刘 拴 张明勇 胡 冰

(武汉科技大学附属天佑医院骨科，湖北 武汉 430064)

1 材料与方法

1.1实验动物 48只3月龄健康新西兰白兔，雌雄各半，购自南京模式动物研究所。

1.2试剂与材料 注射用盐酸氯胺酮(北京双鹤药业股份有限公司)；盐酸异丙嗪注射液(成都倍特药业有限公司)；盐酸利多卡因注射液(山西晋新双鹤药业有限责任公司)；免疫组化SP试剂盒(中国医学科学院生物工程研究所)；Ⅱ型胶原一抗(上海美迪西生物医药有限公司)；胎牛血清(北京生物制品研究所)；注射用青霉素钠(桂林南药股份有限公司)；乙二胺四乙酸、多聚甲醛、DMEM以及胰蛋白酶均购自美国Sigma公司。脱细胞软骨支架材料为本实验室自行制成，经常规消毒等处理后保存于干燥环境中。

1.3仪器设备 手术各操作器械、实验台等由本实验室提供；二氧化碳培养箱(Hcracus公司)；相差倒置显微镜(德国AFM公司)；组织包埋机及切片机(泰维科技有限公司)；显微摄影成像系统(徕卡公司)；数码相机(德国莱次公司)。

1.4实验方法

1.4.1组织工程软骨的制作 采用密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSC，在培养期间，进行光镜观察2次。当细胞间隙变大，出现漩涡状孔隙时添加等体积FBS将胰酶中和，吸出细胞液后将瓶壁上细胞层反复冲洗，制成单细胞悬液。吸取悬液15 ml，离心3 min，弃上清，加入DMEM液重悬单细胞悬液，经细胞计数板计数。取猪膝关节软骨，经清洗、冷冻和干燥处理后分为骨粉末，使用胰酶消化和清洗，消毒后待用。取无菌ACM手工切成4 mm×4 mm×3 mm体积大颗粒，分别放入6孔板中，将稀释至1×106个/ml的BMSC单细胞悬液，滴加至6孔板中，37℃、5%二氧化碳饱和湿度条件下孵育2 h。

1.4.2膝关节软骨缺损动物模型的制作和修复 48只新西兰白兔，随机分为3组，ACM-BMSC组，ACM组，空白对照组。各个组再分为6 w和12 w时间点。将新西兰白兔称重后，记录重量，根据重量，注射盐酸氯胺酮2 ml/kg，每只新西兰白兔注射一支盐酸异丙嗪，注射方式为臂肌注射；对于膝关节区目标手术部位先脱毛后再牢固固定，常规消毒之后给予1%利多卡因麻。于兔膝关节前内侧入路，暴露膝关节，屈曲膝关节，充分暴露股骨内侧踝。制造软骨缺损3 mm深，达软骨下骨且能够感觉到有突破感、孔内渗血。将组织工程化骨植入缺损部位并压满。伸直术侧膝关节后复位髌骨，缝合切口。术后追加使用抗生素，青霉素80万U/d。新西兰白兔分开饲养，自由活动。

1.5主要观察指标 6 w、12 w时分别处死8只新西兰白兔，取出膝关节标本仔细观察。将动物标本常规使用4%多聚甲醛固定后使用EDTA脱钙3个月，常规制备石蜡切片，经HE染色和免疫组化染色后在光镜下观察。同时进行Wakitani组织学评分。Wakitani组织学评分：分为细胞形态、基质染色、表面平整、软骨厚度、接合、总分。细胞形态，全部为透明软骨为0分，大多数为透明软骨为1分，主要是纤维软骨为2分，大多数不是透明软骨为3分，无透明软骨为4分。基质染色，正常为0分，略有减少为1分，显著减少为2分，其他为3分。表面平整，平整超过3/4为0分，居中(1/2～3/4)为1分，不规则为2分，非常不规则为3分。软骨厚度大于2/3为0分，1/3～2/3为1分，不足1/3为2分。接合，接合较好为0分，只有1边接合为1分，均不接合为2分。总分：满分14分，分值越低，软骨缺损修复越好。

其中：被解释变量Lapro为劳动生产率。解释变量Time为时间虚拟变量，表示最低工资标准实施前后，实施前为0，实施后为1。解释变量Treat表示是否落实最低工资标准的虚拟变量，落实为1，未落实为0。Time×Treat表示解释变量Time和Treat的乘积，系数β3表示最低工资标准对于企业劳动生产率的影响。控制变量X表示影响企业劳动生产率的其他因素，包括企业特征和所在地区经济发展水平。

1.6统计学分析 应用SPSS17.0软件进行秩和检验。

2 结 果

2.1实验动物大致观察分析 三组实验动物关节腔没有看到感染积液，没有发生关节腔粘连情况。术后6 w：ACM-BMSC组，与附近正常组织新生软骨完全填充，表面基本接合，表面光滑、乳白色；ACM组新生软骨不完全填充，与附近正常组织有所接合，表面不光滑、偏白色；空白对照组新生软骨填充很少，与附近正常组织不接合，表面裂隙较多、偏白色；术后12 w：ACM-BMSC组完全修复，与附近正常组织完全接合，表面光滑、乳白色；ACM组不完全修复，与附近正常组织接合处仍有裂隙，表面不光滑、偏白色；空白对照组修复较少，与附近正常组织不接合，表面裂隙较多、偏白色。术后6 w和12 w关节缺损部位直接观察结果见图1。

图1 关节缺损部位观察

2.2术后关节组织学观察 术后6 w ACM-BMSC组修复组织与周围组织接合良好，表层可见梭形成纤维细胞，纵轴与表面平行，修复细胞呈圆形透明软骨样细胞，基质染色与周围正常软骨基质比较有所下降，潮线清晰。ACM组修复组织与周围组织有所接合，表层细胞层次排列紊乱，深层可见成纤维样细胞修复，细胞深层可见透明软骨样细胞，基质染色与周围正常软骨基质比较明显下降，潮线无。空白对照组无明显类软骨组织修复，仅有少量类肉芽组织。术后12 w ACM-BMSC组修复组织与周围组织接合良好，表层可见梭形成纤维细胞，纵轴与表面平行，修复细胞呈圆形透明软骨样细胞，基质染色与天然软骨组织接近，潮线清晰。ACM组修复组织与周围组织有所接合，表层细胞层次排列紊乱，深层可见成纤维样细胞，修复细胞深层可见透明软骨样细胞，基质染色与周围正常软骨基质比较明显下降，潮线无。空白对照组无明显类软骨组织修复，仅有少量类肉芽组织。见图2。

2.3Wakitani组织学评分比较 在同一时间段内，不同组间细胞形态、基质染色、表面平整、软骨厚度、接合、总分比较，ACM-BMSC组和空白对照组、ACM组和空白对照组比较，差异显著(P<0.05)；ACM-BMSC组和ACM组比较无差异显著(P>0.05)。见表1。

图2 术后关节组织学观察(HE，×100)

时间组别细胞形态基质染色表面平整软骨厚度接合总分6 wACM-BMSC组1.49±0.441)1.39±0.461)0.79±0.661)0.59±0.611)0.79±0.641)4.99±1.221)ACM组1.79±0.471)1.59±0.481)0.89±0.571)0.59±0.481)0.88±0.541)5.79±0.881)空白对照组2.49±0.331.58±0.471.88±0.540.88±0.571.79±0.468.59±1.2212 wACM-BMSC组1.29±0.481)0.99±0.411)0.88±0.471)0.49±0.491)0.77±0.411)4.43±1.441)ACM组1.49±0.471)1.38±0.441)0.79±0.411)0.59±0.481)0.88±0.541)5.09±1.551)空白对照组2.29±0.441.49±0.371.99±0.751.09±0.331.49±0.378.39±1.11

与空白对照组比较：1)P<0.05

3 讨 论

组织工程学作为一门以细胞生物学与材料学核心内容的新兴学科，其主要通过重新构建组织器官修复和改善疾病，主要分为种子细胞、生物材料和体内微环境等内容〔4～7〕。目前，软骨细胞、充质干细胞是临床上主要使用的细胞类型。在大量人体和动物试验中均有实践证明，国内的多项研究也证实自体软骨细胞在其中有更好的软骨成骨效果〔8～10〕。而异体软骨细胞虽然能够通过包裹基质被植入，但却容易遭到自然杀伤细胞的攻击。有研究指出，若采用同种异体软骨细胞复合的支架材料进行关节软骨修复，有确切效果，在一定程度上丰富了种子细胞的来源〔11，12〕。间充质干细胞具备多种分化的潜能，且若应用BMSC不仅取材来源与操作方便，对供体也不会产生明显影响，分离培养十分方便，体外增殖能力也十分理想，来源也不受限制〔13〕。

目前，组织工程中支架材料主要包括两种，一种是天然生物可降解材料，另一种是人工合成生物可降解材料〔14,15〕。组织工程支架材料需要有良好的生物相容性和降解性，具备三维多孔立体结构，要有一定的机械强度。在软骨组织工程中，支架材料则应该有足够的孔隙结构，促进细胞黏附和增殖，可以通过表面修饰等，对细胞的黏附和生长进行调控〔16〕。还需要具备一定的弹性，支架还需要能够和周围的组织融为一体，不容易缺损和脱落。当然，这些都是理想状态的要求，至今尚未发现存在。

本文所获得的BMSC作为种子细胞，生长良好，纯度较高。生物材料方面，细胞外基质(ECM)作为软骨支架材料中的重要部分，具备连接、支持等作用。通过处理后，ACM最大程度保留了细胞赖以生存的细胞外基质，与生物天然软骨基质成分十分接近，适合细胞生存。近几年，细胞和支架的接种技术的不断发展，临床上已经出现了沉淀法、浸渍法、吸附法等多种技术。本文结果显示脱细胞软骨支架材料在解剖和组织结构上均基本达到了本研究预期的修复目标，但其修复细胞的排列方式和正常软骨细胞依然存在一定的区别。研究更为完美的修复方法有着更为重要的实践价值。

4 参考文献

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