薛　莱，黄　波，谢　炜，吴　堃

(1.江油市人民医院 临床药学科，四川 江油　621700；2.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义　563099；3.重庆市人民医院 肝胆外科，重庆　400013)

随着生活水平的提高，糖尿病已成为危害人类健康的全球性公共卫生问题。糖尿病极易引起肾脏、视网膜、心脑血管、周围血管等一系列严重并发症，导致糖尿病患者出现残疾甚至死亡[1]。故糖尿病及其并发症发生的机制及防治已成为当今相关领域研究的重点和热点问题。国内外对于糖尿病心、脑、肾、视网膜并发症的研究较为深入，但对于糖尿病导致的肝损伤(糖尿病合并非酒精性脂肪肝)仍存在认识不足及重视不够的问题。糖尿病引起的非酒精性脂肪肝已成为世界范围内最常见慢性肝病[2]，具有较高的发病率和死亡率，严重影响人类的生命健康和生活质量，其发生机制目前尚未完全阐明，亦无特异性治疗靶点和针对性药物。因此，急需建立稳定可靠、操作简单方便，且与临床病理生理过程相似的动物模型，以便对该病进行更多深入研究。本研究拟采用高糖高脂饲料联合多次小剂量链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导小鼠2型糖尿病形成，然后继续予高糖高脂饲料喂养，直至非酒精脂肪肝出现，建立糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物SPF级4～6周龄雄性昆明小鼠，体重15～20 g，由重庆医科大学动物实验中心提供[许可证号：SYXK(渝)：2012-0001]。

1.1.2仪器及试剂STZ购自Sigma公司，用枸橼酸缓冲液溶解后，调节pH值4.2～4.4，临用前配制；胰岛素放免检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所；总胆固醇(total cholesterol,TC)检测试剂盒、甘油三酯(triglyceride,TG)检测试剂盒、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒均购自南京建成生物技术公司。其余试剂均为国产分析纯。台式低温离心机(Thermo 公司)，ELX-800酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1动物模型建立小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组：即正常对照组(control)和模型组(model)，每组12只。模型组小鼠予高糖高脂[成分：10%蔗糖，10%蛋黄，10%猪油，1.5%胆固醇，0.5%胆盐和68%基础饲料混合]饲料喂养4周后，连续5 d给予STZ(40 mg/kg/day,i.p.)。7 d后(即STZ 7 d)，用强生稳豪倍易型血糖仪测定小鼠空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG)，高于11.1 mmol/L的小鼠视为糖尿病小鼠(diabetic model,DM)[3]。糖尿病小鼠继续给予高糖高脂饮食喂养4周；检测肝脏功能相关指标及形态学变化，根据“非酒精性脂肪肝诊断标准”[4]确定糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型建立。正常对照组小鼠给予常规饲料喂养4周后，连续5 di.p. 等量的枸橼酸缓冲液，7 d后(STZ 7d)检测FBG值，继续给予常规饲料喂养4周。所有小鼠在继续喂养的第1周(1周)、第2周(2周)、第3周(3周)和第4周(4周)的最后1 d测定小鼠的体重和FBG。

1.2.2生化指标检测糖尿病形成4周后，眼眶取血，于4 ℃ 3 000 ×g离心15 min，取上清液。按各试剂盒说明书操作，酶标仪分别检测不同波长的OD值，以计算相应指标的浓度：510 nm(AST和ALT)、520 nm(ALP)、490 nm(TC和TG)。另外，按照试剂盒说明书操作，放免法在γ计数仪(SN-684型放射免疫计数器)上检测胰岛素含量，以μIU/mL表示。每组结果来源于8只独立小鼠。

1.2.3组织病理学观测处死小鼠，分离肝脏组织，4%的多聚甲醛溶液固定6 h后，用不同浓度的乙醇和二甲苯逐级脱水，包埋入石蜡，作3～5 μm冠状切片，进行组织HE染色，于高倍显微镜下观察肝脏组织形态学改变。

2　结果

2.1一般情况实验结束时，正常对照组小鼠一般情况较好，毛色光滑，活动自如，饮食饮水正常，尿量正常，实验期间无死亡；模型组小鼠则毛色晦暗，精神萎靡，饮食量和尿量均是正常对照组的2倍，小鼠生活垫料潮湿，需要每日更换。实验期间，模型组小鼠共死亡4只。

予STZ前，正常对照组与模型组小鼠体重无明显差异(P> 0.05)；予STZ 7 d后，两组小鼠体重均明显增加(P<0.01，与予STZ前比较)，但二者之间无差异(P> 0.05)。随时间增加，正常对照组小鼠体重逐渐增加(P<0.01)，实验结束时增加了101.6%。模型组小鼠体重在糖尿病形成后继续喂养的第1周和第2周继续增加(P<0.05)，但在第3 周和第4 周体重逐渐下降，且与予STZ 7 d时小鼠体重相比较无明显差异(P> 0.05)。至实验结束时，模型组小鼠体重是正常对照组的0.59倍(P<0.01)(见图1)。

aaP<0.01 与STZ前相比; bP<0.05,bbP<0.01 与STZ 7d相比; cP<0.05,ccP<0.01 与对照组相比。图1　小鼠体重变化

2.2血糖及血清胰岛素水平的变化如图2所示，给予STZ 7 d后，模型组小鼠FBG值显著升高(P<0.01)，远大于11.1 mmol/L，并保持在20 mmol/L以上直至实验结束。与正常对照组比较，FBG升高了3.42倍。正常对照组的血清胰岛素为(27.1±6.4)μIU/mL，糖尿病模型组为(112.6±15.8)μIU/mL，升高了3.15倍(P<0.01)。

aa：P<0.01 与对照组相比。图2　小鼠血糖及胰岛素水平变化

2.3血脂和肝功能的变化如图3所示，与正常对照组相比，模型组小鼠TC和TG分别升高了3.10倍和1.8倍(P<0.01)；同时，肝功能指标ALT、AST、ALP水平均显著增加，分别增加了89.3%，109.7%和252.9%(P<0.01)。

2.4肝脏组织病理学改变如图4所示，正常对照组小鼠肝脏(见图4 A)肝小叶结构完整清晰，肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状整齐分布，肝细胞形态、大小正常；予STZ 7 d后(见图4 B)，肝小叶结构尚清晰但不完整，肝细胞排列开始变得紊乱，部分肝细胞可见脂肪样变，肝细胞内出现少量脂肪空泡；糖尿病形成4周后，模型组小鼠(见图4 C)肝组织着色浅，肝小叶结构消失，肝索排列混乱，肝细胞肿胀明显，胞浆内可见大小不一脂滴，局部伴炎症细胞浸润，细胞内出现大量脂肪空泡。

aa：P<0.01，与对照组相比。图3　小鼠血脂和肝功能相关指标变化

A:正常对照组;B:STZ 7 d后;C糖尿病形成4周；HE×200。图4　糖尿病小鼠肝组织病理变化

3　讨论

糖尿病是由于机体内胰岛素缺乏或抵抗引起的以糖脂代谢紊乱为主要特征的内分泌系统疾病，对人类的生命和生活质量有极大的影响。肝脏是调节糖脂代谢最重要的器官，与糖尿病的发生紧密相关。流行病学研究发现，超过70%的2型糖尿病患者伴有不同程度的肝损伤[5-6]，而肝损伤继发的糖脂代谢异常及胰岛素敏感性降低又反过来导致或加重糖尿病的发生[7]。因此，糖尿病是肝脏疾病发生发展的独立危险因素[8]，故糖尿病并发的肝损害也叫糖尿病性肝病(diabetic hepatopathy)。临床上最常见的糖尿病性肝病是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)[9-10]，主要表现为脂肪细胞在肝脏的聚集。随着病情的发展，NAFLD可能出现肝细胞损伤伴炎症因子产生，发展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，进一步恶化为肝纤维化，甚至出现肝硬化、肝细胞性肝癌或肝功能衰竭等终末期肝病[11]。现常采用NAFLD模型代替糖尿病肝损伤模型，但不同造模方法的形成机制及病理改变不尽相同[12]，并不能准确地反映糖尿病所导致肝损伤的病理生理过程和病理改变特点。因此，在糖尿病形成基础上，我们予高糖高脂饲养，模拟人类糖尿病肝损伤形成的整个过程，拟建立与人类2型糖尿病肝损伤较为相似的动物模型。

目前，糖尿病模型建立方法主要有：转基因动物、自发性糖尿病动物模型和化学药物诱导法等。化学药物诱导法因其经济、操作方便的特点而被广泛用于糖尿病模型的建立[13]。其常用药物为四氧嘧啶(alloxan)和STZ。二者均通过破坏胰岛β细胞，降低体内胰岛素水平导致糖尿病。但四氧嘧啶在破坏胰岛β细胞的同时，也可造成肝、肾组织中毒性损害，因此目前已经很少应用。研究发现，长期高脂肪饮食诱导使小鼠产生胰岛素抵抗，联合腹腔注射低剂量STZ的方法造模，能够成功建立发病过程自然且与人类2型糖尿病代谢特征相似的小鼠模型[14]。因此本实验采用高糖高脂饮食喂养4周后，连续5 d多次小剂量给予STZ建立糖尿病模型，而后继续予高糖高脂喂养4周。实验结束时，糖尿病小鼠的FBG维持在较高水平，小鼠出现胰岛素抵抗，伴血脂紊乱等典型2型糖尿病表现。

糖尿病合并非酒精性脂肪肝的主要表现为肝功能损伤和形态的改变[15]。本研究中，在糖尿病形成4周后，模型组小鼠ALT、AST、ALP均显著升高，符合非酒精性脂肪肝诊断标准[4]，提示肝功能受损。组织形态学检查可直接客观地观察肝脏组织病理损害的严重程度，是临床上诊断疾病和评价治疗效果的金标准。NAFLD的特征性表现为肝细胞弥漫性脂肪变性[4]；NASH的表现为肝细胞脂肪变性基础上伴发炎性细胞浸润。本实验中，肝脏组织HE染色结果显示，予STZ 7 d后，糖尿病小鼠肝组织内见少量脂肪空泡，肝细胞轻微受损；继续高糖高脂喂养4周后，模型组小鼠肝细胞内出现大量脂肪空泡，局部伴炎症细胞浸润。综合肝功能和病理检查结果，本实验成功地建立了小鼠糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型。

综上所述，本实验在前人研究的基础上，通过较为长期的“糖毒性”和“脂毒性”饮食联合STZ诱导方式，在糖尿病形成基础上成功建立糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型，较好地模拟了人类2型糖尿病合并非酒精性肝损伤的病理生理过程。本方法操作简单、可行性高、模型稳定，可以广泛用于2型糖尿并合并非酒精性脂肪肝相关机制和药物作用的研究。