张　倩，　周可柔，　胡倩倩，　任　曼，　靳二辉，　顾有方，　李升和

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳　233100)

支持细胞(Sertoli cell)，在精子发生和成熟过程中，具有支持、保护和营养生精细胞作用，促进雄激素结合蛋白(androgen binding protein，ABP)合成，ABP可与雄激素结合，以保持生精小管内雄激素水平，进而促进精子发生[1]，使支持细胞体外培养研究成为探究雄性生殖细胞的基础，在生物学研究领域具有广阔应用前景。20世纪90年代初，Cameron创立了睾丸支持细胞的分离培养方法[2],目前国内外采用方法均由其沿袭而来，但由于其方法复杂，操作步骤繁杂、实验时间长、对细胞损伤大、睾丸支持细胞产量低；另外39 ℃下培养对细胞造成损伤，睾丸支持细胞活性低，不利于开展后续实验[3]。国内学者针对这些缺陷进行了许多改良，曹博等采用睾丸酶次第消化制成细胞悬液后[4]，于37 ℃无CO2培养箱中培养48 h后，用胰蛋白酶和DMEM/F-12培养液吹打，有效去除了生精细胞和其他贴壁细胞，比39 ℃高温培养和低渗法去除生精细胞方法简便，并且获得支持细胞浓度达到90%以上[5]。

在睾丸支持细胞原代培养中，提高分离培养支持细胞纯度一直是其重点所在[6]。从睾丸组织中获得高纯度支持细胞可以采用机械分离法和酶法[7-10]。机械分离法难以获得大量高纯度细胞，酶法是体外培养时分离细胞最有效的方法[11]。本试验采用两步酶单次消化法，在前人研究的基础上缩短了酶消化时间，减少了对细胞的损伤，在37 ℃水浴震荡消化过程中可使睾丸曲细精管充分消化，细胞培养24 h后用预冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻轻洗涤并更换新的完全培养液，提高细胞的收获量和纯度，同时在两步酶消化过程中可充分去除睾丸中的成纤维细胞、间质细胞和生精细胞。……