夏　飞， 李煜田， 汪梦雯， 杨　苗， 曾　桥， 秦俊哲

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安　710021)

0　引言

茯茶是黑茶精加工的一种，其外形整齐如砖片，内质金花普茂，菌香浓郁.开汤后色泽红浓、香气纯正、滋味醇厚，具有消食健胃、降血压、降血脂等保健效果，素来是边疆地区牧民必不可少的日用饮品[1].随着人们对自身保健的重视，茯茶因其特有的保健功效，近年来越来越受到人们的青睐，同时茯茶所特有的“金花”结构，也引起了许多科研工作者的浓厚兴趣.

茯茶中特有的“金花”，是一种由冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)形成的金黄色闭囊壳结构(如图1所示)，形似金黄色小花盛开，因而冠突散囊菌也被俗称为“金花菌”.在茯茶加工过程中，经特定工艺压制成型的茯茶中的冠突散囊菌在一定的温、湿度条件下形成“金花”的过程，被形象地称为“发花”.从古至今，茯茶中“金花”的丰富度是判断茯茶品质的重要指标之一，因而茯茶中冠突散囊菌的快速大量生长也成为现代茯茶加工工艺改良的关键.

(a)茯茶中的“金花”　　(b) 闭囊壳结构图1　茯茶中特有的“金花”及冠突散囊菌的闭囊壳结构

近年来，越来越多的研究者开始关注微生物在茯茶品质形成过程中的作用，并开展微生物对茯茶品质形成机制相关的研究[2-4].建立在传统自然“发花”工艺基础上的茯茶，其加工过程中微生物种类多而杂，茯茶发酵周期长且易染杂菌，导致产品品质不稳定，制约着茯茶品质的提升.为提高茯茶的“发花”效果，已有研究者采用人工接种“发酵剂”的形式进行茯茶制备.茯茶“发酵剂”的研制是提高茯茶品质的有效途径之一.“发酵剂”即采用人工培养的方式，产生大量“金花菌”的菌丝或者孢子，在茯茶原料二次汽蒸后、制砖之前进行添加.秦俊哲等[5，6]通过接种茯茶发酵剂的方式进行茯茶加工，能明显缩短茯茶“发花”周期，降低污染杂菌的概率，提高“发花”效率.然而，该茯茶“发酵剂”采用固态发酵手段制备，含有杂质较多且制备过程中易污染杂菌.通过液体培养基在密闭环境中发酵则可避免其他微生物对发酵剂污染的问题.因此，从茯茶中分离“金花菌”并对其液体生长培养基条件进行优化从而获得大量孢子和菌丝体的生长，为茯茶发酵剂的研制奠定坚实研究基础就显得尤为重要.

本研究从陕西泾阳出产的高品质茯茶中分离“金花菌”，通过形态学及分子生物学方法进行初步鉴定；并对其菌丝体生长和孢子产生最适培养基组成进行优化，为研制茯茶“发酵剂”奠定研究基础.本研究对于茯茶发酵剂的研制，进而提高茯茶品质具有重要的应用价值.

1　材料与方法

1.1　实验材料与仪器

1.1.1菌株

菌株Eurotiumsp.JW043分离自陕西泾阳茯茶产品，经纯化鉴定后，保存于本研究室.

1.1.2试剂

硝酸铵、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、甘氨酸、乳糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、磷酸氢二钾、硫酸镁等试剂均为分析纯，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.真菌DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司.

1.1.3培养基

(1)改良马丁培养基：单因素优化培养实验所用培养基为改良马丁培养基，每1 000 mL培养基组成为：碳源20.0 g、氮源2.0 g、磷酸氢二钾1.0 g，硫酸镁0.5 g.加超纯水定容至1 000 mL，分装，121 ℃高温湿热灭菌20 min.

(2)PDA培养基：用于“金花菌”分离、纯化.葡萄糖20 g、去皮土豆200 g煮20 min后过滤留汁备用、琼脂18 g(固体培养基时添加).加超纯水定容至1 000 mL，分装，121 ℃高温湿热灭菌20 min.

1.1.4仪器

粉碎机、涡旋振荡仪、THZ-C恒温震荡器(江苏太仓市实验设备厂)、恒温培养箱(江苏太仓市实验设备厂)、光学显微镜、PCR仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统(复日科技).

1.2　研究方法

1.2.1菌株的分离及纯化

将陕西泾阳茯茶使用茶针撬开后，取其中“金花”丰富的茯茶材料粉碎，取适量于无菌10 mL离心管中，加入5 mL无菌水置于涡旋振荡仪上震荡10 min，取上清稀释后涂布于PDA培养基上.28 ℃静置培养5天，挑取单菌落于PDA培养基上划线，纯化数次.

1.2.2菌株Eurotiumsp.JW043的鉴定

(1)形态学观察：无菌条件下挑取菌种Eurotiumsp.JW043菌丝转接至数个PDA平板培养基上，28 ℃倒置培养5天后，选取菌斑生长良好的菌落进行平板观察、拍照.

(2)转录组间隔区序列测序：无菌条件下刮取平板上单菌落菌丝体，采用天根真菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA后，使用通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[7]进行转录组间隔区序列(Internal Transcribed Spacer，ITS)扩增.PCR反应在25μL体系中进行，包括12.5μL的ExTaqDNA聚合酶预混液(Takara,Japan)，上下游引物各1μmol/L，1μL模板DNA，9.5μL超纯水.PCR扩增温度条件为:95 ℃预变性5 min，之后进行30个循环的扩增，每个循环包括94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s以及72 ℃延伸1 min.循环结束后，最后72 ℃延伸10 min[8].PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳确认片段大小后，交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析.测序结果提交NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行比对，并采用Mega软件绘制系统发育树，选用Neighbor-Joining绘图算法，重复迭代1 000次[9].

1.2.3发酵条件优化

(1)碳、氮单因素条件筛选：对影响Eurotiumsp.JW043菌丝体生长和孢子产生的碳源和氮源分别进行筛选.每1 000 mL培养基中氮源为酵母浸膏2.0 g，分别测定20.0 g乳糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖及蔗糖对菌丝体生长和孢子产生量的影响；对于氮源的筛选，同样每1 000 mL培养基中固定葡萄糖20.0 g为碳源，研究2.0 g硝酸铵、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、甘氨酸对菌丝体生长和孢子产生的影响.碳、氮单因素条件筛选培养基中均添加硫酸镁0.5 g，磷酸氢二钾0.1 g.将接种好的培养基于150 rpm，28 ℃摇床培养7天.之后，对发酵液中孢子数和菌丝湿重分别进行测定.

(2)正交试验：在单因素筛选碳氮源实验基础上，选取蔗糖作为碳源、酵母浸膏作为氮源、MgSO4为无机盐，采用正交设计助手(Orthogonality Experiment Assistant II，v3.1.1)软件设计3因素3水平的正交试验.按照正交实验设置，配制好培养基后接种Eurotiumsp.JW043，于150 rpm，28 ℃条件下摇床培养7天.培养结束后，对发酵液中孢子数和菌丝湿重分别进行计数和湿重测定.

1.2.4孢子计数及菌丝体重量测定

孢子计数采用血球计数板方法进行.菌丝湿重的测定过程如下：发酵液中的菌丝体通过5 000 rpm离心10 min，采用去离子水清洗、再次离心去上清，重复2～3次之后，用吸水纸吸干多余水分后称重即为菌丝湿重.

2　结果与讨论

2.1　菌株形态学观察及ITS序列系统发育树分析

菌株Eurotiumsp.JW043在PDA固体培养基上28 ℃培养2天后,可形成直径约1 cm的菌落，菌落外围有一圈白色至浅黄色菌丝体，内部近于橄榄浅黄色(如图2(a)所示).培养至第4天，边缘颜色逐渐变深，中央部分颜色也逐渐加深，近于褐色(如图2(b)所示).培养6天后中央部分变成棕色，菌落边缘形成明显棕色圈，色素在培养基上辐射面较大(如图2(c)所示).培养至第8天，菌落直径明显增加，菌落中心呈现黑褐色，黑褐色外围绕一圈明显的黄色物质，平板背面呈现深棕色(如图2(d)所示).

(a)接种后2天　　　　(b)接种后4天

(c)接种后6天　　　　(c)接种后8天图2　菌株Eurotium sp.JW043在PDA平板的生长情况

将菌株Eurotiumsp.JW043的转录组间隔区ITS序列与NCBI数据库比对，结果显示该菌株与数个Eurotiumcristatum菌株具有非常高的同源性.通过Mega构建系统发育树，菌株Eurotiumsp.JW043与散囊菌属的其他几个种明显聚类在一簇；与曲霉属、青霉属、以及拟青霉属明显分布在两个簇中(如图3所示).在散囊菌属的簇中，Eurotiumsp.JW043菌株和其他两个冠突散囊菌Eurotiumcristatum strain EN220和Eurotiumcristatum strain UPM-A13具有非常高的同源性，其次与Eurotiumamstelodami(阿姆斯特丹散囊菌)和Eurotiumrubrum(赤散囊菌)组成一个较大的分支；该分支与外围的Eurotiumrepens和Eurotiumherbariorum形成散囊菌属类群.基于分子生物学的鉴定结果，菌株Eurotiumsp.JW043可确认为散囊菌属微生物.

关于“金花菌”的分类鉴定，许多学者都进行过相关研究.早在1981年，仓道平等[10]认为茯茶中优势菌是灰绿曲霉群中的谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri).1990年，温琼英[11]通过电镜观察及培养特征，认为茯茶中优势菌株与英联邦真菌研究所的冠突曲霉模式菌株172280的培养特征和显微特征一致，因此将该菌确定为冠突曲霉.随后温琼英和齐祖同对该菌作了进一步的研究，正式将该菌命名为冠突散囊菌[Eurotiumcristatum (Raper & Fennel 1) Malloch & Cain]，无性型名称为针刺曲霉(Aspergillus spiculosus Blaster)，异名为冠突曲霉(Aspergillus cristatum Blaster)[12].本研究从陕西泾阳出产的茯茶中分离纯化出一株“金花菌”，经形态学观察，其平板生长状况(如图2所示)与冠突散囊菌形态学具有较高的相似性.对分离菌株的ITS序列进行测序，结合系统发育分析及平板生长状态，进一步确认其为散囊菌属真菌.由于缺乏更多的证据证明其种水平、乃至亚种水平上的分类信息，因此将该菌株命名为Eurotiumsp.JW043.目前，采用真菌的转录组间隔区ITS序列进行分子水平的鉴定，具有速度快、指向性强、准确性高等优点.ITS序列既具有一定的进化差异性，也具有特定区域的保守性，是用于真核生物鉴定、分类以及进化研究的重要分子标记之一.通过分子生物学鉴定微生物的分类信息目前已经被众多研究者广泛应用[13-15].

图3　菌株Eurotium sp.JW043的系统发育分析

2.2　培养基碳氮源筛选

固定碳源为葡萄糖，开展影响菌株Eurotiumsp.JW043产孢子和菌丝生长培养基氮源的单一因素筛选.结果表明，采用蛋白胨2 g/L培养时，菌株Eurotiumsp.JW043发酵液中产孢量最大，可达到9.84±1.16×107个/mL；以牛肉膏和酵母浸膏为氮源时，产孢量次之，分别可达到9.27±1.83×107个/mL和9.08±1.16×107个/mL(如图4(a)所示).氮源对菌丝湿重的影响如图4(b)所示，以硝酸铵为氮源的菌丝湿重量最大，可达到0.70±0.08 g；酵母作为氮源对菌株Eurotiumsp.JW043的菌丝生长量影响仅次于硝酸铵，其菌丝湿重量为0.46±0.056 g.综合考虑对菌株Eurotiumsp.JW043的产孢量和菌丝湿重的影响，选取酵母浸膏用于后续正交试验的氮源.

以酵母浸膏为氮源，对菌株Eurotiumsp.JW043生长的碳源进行筛选.分别采用20.0 g/L 的乳糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖和蔗糖作为碳源.其中20.0 g/L乳糖、蔗糖更能促进菌株Eurotiumsp.JW043孢子产生，分别达到1.21±0.13×108个/mL和1.11±0.14×108个/mL(如图4(c)所示).蔗糖对菌丝湿重的影响较乳糖更为明显，用蔗糖作为碳源，其浓度为20.0 g/L时，菌丝湿重可达到0.76±0.08 g；麦芽糖做碳源时，菌丝湿重达到最大，为0.85±0.08 g，然而其产孢数量最少(如图4(d)所示).综合考虑碳源对菌丝量、产孢量以及原料的成本等问题，选用蔗糖进行碳氮源的正交试验.

菌株Eurotiumsp.JW043是一株制备茯茶发酵剂的潜在资源菌株，对于提高茯茶“发花”品质、缩短茯茶发花周期具有重要的应用价值.因此，对于该菌株最适生长条件的探索显得尤为重要.本研究首先采用单因素优化的方法，筛选出蔗糖和酵母浸膏分别作为菌株发酵的碳源和氮源.已有研究证实，蔗糖是最利于菌丝生长的碳源之一[16，17]，与本研究碳源对菌丝生长影响的单因素实验结果基本一致(如图4(d)所示).

(a)不同氮源对产孢数量的影响

(b)不同氮源对菌丝湿重的影响

(c)不同碳源对产孢数量的影响

(d)不同碳源对菌丝湿重的影响图4　菌株Eurotium sp.JW043碳氮源单因素优化

2.3　碳氮源正交优化培养基

实验应用正交设计助手II v3.1.1(Orthogonality Experiment Assistant II v3.1.1)设计蔗糖、酵母浸膏以及硫酸镁的3因素3水平正交试验，探究最适合菌株Eurotiumsp.JW043产孢以及菌丝生长的培养基组成.在单因素实验结果上，对培养基氮源和碳源浓度水平进行调整.如表1所示，对于菌株Eurotiumsp.JW043的产孢量，极差RA>RC>RB，即碳源蔗糖对产孢量的影响最大，其次是无机盐硫酸镁，最后为氮源酵母浸膏.根据各因素各水平对应结果的平均值，可以判断最适合菌株孢子产生的培养基条件为A2B3C1，即每100 mL培养基中含有蔗糖5.0 g、酵母浸膏1.5 g、硫酸镁0.5 g和磷酸氢二钾0.1 g.

表1　碳氮源对菌株Eurotium sp.JW043孢子产生正交条件设计及结果

如表2所示，碳源、氮源以及无机盐硫酸镁对于菌株Eurotiumsp.JW043菌丝湿重生长的影响程度不尽相同，极差RC>RA>RB，表明无机盐硫酸镁对菌丝湿重生长的影响最大，其次为碳源蔗糖，最后为氮源酵母浸膏.而根据各因素各水平对应结果的平均值，可以判断最适合菌株Eurotiumsp.JW043菌丝湿重生长的培养基条件为A3B3C1，即每100 mL培养基中含有蔗糖7.5 g、酵母浸膏1.5 g、硫酸镁0.5 g和磷酸氢二钾0.1 g.

表2　碳氮源对菌株Eurotium sp.JW043菌丝湿重生长的正交条件设计及结果

本研究中基于单因素培养实验，进一步采用正交试验方法，分别确定适合菌株Eurotiumsp.JW043菌丝生长以及产孢量提高的培养基成分组成.方差值R大小表明该因素对于产物的影响程度大小，并根据各水平产物含量平均值确定最适培养基组成.真菌的液体发酵过程中通常不产生或者只产生少量的孢子.本研究中液体发酵周期较长，发酵后期营养条件不足可能会导致孢子的产生.此外，已有木霉属真菌产孢子的最适液体培养条件探索相关研究[18,19].碳源可以抑制孢子的产生[16]，而改变培养基碳氮比例在一定程度上可以促进孢子的产生.本研究中最适合孢子产生培养基的碳源与最适合菌丝生长的培养基碳源相比下降了30%，在一定程度上与前人研究结果一致.相对于无机氮源而言，有机氮更利于孢子的形成[20]，本研究中采用酵母浸膏作为产孢培养基的氮源，对于冠突散囊菌孢子的形成在一定程度上具有贡献作用.

3　结论

本研究从陕西泾阳茯茶中分离出一株“金花菌”，结合形态学和分子生物学鉴定方法确定其为散囊菌属真菌，命名为Eurotiumsp.JW043.并对其菌丝生长和产孢的培养基条件进行优化.通过单因素实验筛选蔗糖和酵母浸膏分别为培养基碳源和氮源；通过正交试验发现，适于该菌株孢子产生的培养基组成为100 mL培养基中含蔗糖5.0 g、酵母浸膏1.5 g、硫酸镁0.5 g和磷酸氢二钾0.1 g；适于该菌株菌丝生长的培养基为100 mL培养基中含有蔗糖7.5 g、酵母浸膏1.5 g、硫酸镁0.5 g和磷酸氢二钾0.1 g.本研究对于进一步开发菌株Eurotiumsp.JW043为茯茶发酵剂，提高茯茶“发花”效率具有一定的应用价值.