舒静，姜源，庄翔，陈俊霞

（1.西南医科大学附属医院 检验部，四川 泸州 646000；2.重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室，重庆 400016）

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，目前膀胱癌的治疗尚无有效靶点，膀胱癌发生发展的关键环节与分子机制有待阐明[1]。核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease inhibitor, RI）是胞浆内1个由460个氨基酸组成的酸性蛋白[2]。笔者前期运用GST pull down与Co-IP等证明RI与整合素连接激酶（intergrin-linked kinase, ILK）在体内外的直接结合[3]。ILK是1个丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，它可以靶向多条信号通路促进细胞恶性转化及上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition, EMT）[4]。本研究通过探讨RI与ILK相互作用对膀胱癌EMT与转移的作用，为RI作为膀胱癌诊断与治疗新的靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人膀胱癌EJ细胞系（中国科学院上海细胞库），无特定病原体（SPF）级BALB/c裸鼠（本校实验动物中心），胎牛血清、RPMI 1640（Gibco公司 ），LipofectamineTM2000（Invitrogen公司），过表达载体 pCMV-3×flag-ILK 与 pCMV-3×flag、 慢病毒LV5-RI homo与LV5-NC（本实验室保存），兔抗人RI多克隆抗体（本实验室保存），兔抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2, MMP-2）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9, MMP-9）、N钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、扭转蛋白（Twist）、核转录因子（Snail）、重组人S100钙离子结合蛋白A4（S100A4）、信号转导蛋白Smad2（Smad2）与βactin、鼠抗人ILK（Bioworld公司），荧光二抗（中杉金桥公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染与慢病毒感染 含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培养EJ细胞。按照说明书，用LipofectamineTM2000分别转染pCMV-3×flag-ILK或pCMV-3×flag至EJ细胞，48 h后，以0.4 g/L的G418筛选14 d，细胞收获后分别命名为EJ-ILK或EJ-FLAG。另以感染复数（MOI）=20的慢病毒LV5-RI homo或LV5-NC感染EJ细胞，48 h后，以0.2 g/L的嘌呤霉素筛选细胞收获后分别命名为EJ-RI或EJ-LV5。

1.2.2 免疫荧光检测细胞 细胞爬片后，或冷冻组织切片后，80%冷丙酮固定10 min，37℃下3% BSA封闭30 min，随后4℃下1∶100稀释的一抗孵育过夜，37℃下荧光二抗孵育2 h，除ILK使用488标记的羊抗鼠二抗，其余均用Cy3标记的羊抗兔二抗。于Leica激光共聚焦显微镜下进行图片获取。

1.2.3 细胞形态观察 稳转细胞系于倒置相差显微镜下观察形态。

1.2.4 Western blot分析蛋白表达 总细胞蛋白裂解后以30 μg每孔上样，经10%SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，封闭2 h后，4 ℃下1∶500稀释的一抗孵育过夜，再以1∶2 000稀释的HRP标记的二抗37℃下孵育2 h，ECL发光显色，并用Quantity One软件进行定量分析。

1.2.5 裸鼠移植瘤模型复制 收集对数期细胞制备悬浊液，以2×106个/只接种于4周龄雄性BALB/c裸鼠背上，每组10只，30 d后处死裸鼠，获取移植瘤及肺组织，移植瘤组织液氮冷冻后，切片，免疫荧光标记，并于激光共聚焦显微镜下观察，肺组织固定，包埋，切片，HE染色后进行病理学检查。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，两两比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RI与ILK在EJ稳转细胞系中的表达

构建稳定过表达RI的EJ细胞（EJ-RI）、稳定过表达ILK的EJ细胞（EJ-ILK）、稳定感染空载LV5的EJ细胞（EJ-LV5）、与稳定转染空载FLAG的EJ细胞（EJ-FLAG）。EJ-RI细胞RI蛋白荧光强于各对照组，而EJ-ILK细胞ILK蛋白荧光强于各对照组（见图1）。

2.2 RI与ILK共定位

运用免疫荧光技术，Alexa 594标记RI蛋白（红色），Alexa 488标记ILK蛋白（绿色），Dapi染核（蓝色），激光共聚焦扫描观察EJ细胞中RI与ILK的表达，RI与ILK胞质胞核均有表达，两者融合之后可呈黄色，存在共定位的现象，两者存在相互作用。见图2。

2.3 稳转细胞系细胞形态

倒置相差显微镜下观察各稳转细胞形态，EJ-RI细胞、EJ-LV5细胞、EJ-FLAG细胞与EJ细胞均呈现上皮型细胞形态，而EJ-ILK细胞呈明显梭形、纺锤形，具有间质型细胞特点。见图3。

2.4 EMT标志物在各稳转细胞系中的表达

Western blot结果显示，EJ-RI组与EJ组比较，E-adherin表达水平升高（P＜0.05），而EJ-ILK组与EJ组比较，间质标志物MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Twist、Snail与S100A4表达水平升高（P＜0.05）。见图4和附表。

2.5 裸鼠移植瘤中RI、ILK与EMT标志物表达

图1 RI与ILK在EJ细胞中表达 （免疫荧光）

图2 RI与ILK在EJ细胞中的共定位 （免疫荧光）

图4 EMT标志物检测结果 （Western blot）

复制裸鼠移植瘤模型，移植瘤切片免疫荧光检测相关蛋白表达。EJ-RI组高度表达RI与上皮标志物E-cadherin，EJ-ILK组高度表达ILK与间质标志物MMP-2、MMP-9和Vimentin。见图5。

2.6 裸鼠自发性肺转移

HE染色裸鼠肺切片，EJ-RI组与对照相比观察到自发性肺转移减少，EJ-ILK组与对照比较肺转移结节增多。见图6。

图5 移植瘤RI、ILK与EMT标志物的表达 （免疫荧光）

附表 各组蛋白EMT标志物比较

续附表

图6 裸鼠肺病理切片图（HE）

3 讨论

RI具有抑制核糖核酸酶A（RNaseA）的活性，可以调节mRNA、rRNA等的含量[5]。既往研究表明，RI能与具有低RNaseA活性的血管生成素（angiogenin，ANG）发生直接结合，通过相互作用抑制ANG的活性，负性调节ANG介导的rRNA的转录和核糖体的生成，并抑制肿瘤血管生成[6-8]。此外，研究还发现RI二级结构中具有LRR模体，LRR模体包含2段平行排列的α-螺旋，其中存在每隔7个规律性排列的亮氨酸残基，LRR模体为RI与其他蛋白质发生相互作用提供了有效的平台[2]。

ILK是1个丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，其位于细胞黏着斑上，可以靶向催化蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）并活化下游的哺乳动物雷帕霉素靶 蛋 白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[9-10]。ILK作为协调细胞外基质和生长因子的信号转导多功能效应器，在调控细胞的生长、分化、黏附、迁移、侵袭、血管生成及EMT等基本过程中起核心的作用[11]。EMT是肿瘤发生转移过程中的重要启动步骤，EMT过程中上皮细胞获得间质细胞的特点，减弱细胞间黏附，破坏细胞极性，获得侵袭、迁移与浸润能力的细胞，有利于肿瘤细胞转移到其他组织和器官，并在远处形成转移灶[12]。近年来研究发现，ILK能通过直接或间接作用促进EMT的发生；ILK的表达与EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Snail及Β-Catenin等的表达密切相关[4]。ILK在多种肿瘤侵袭转移中高表达，其有望成为肿瘤治疗中1个重要的干预靶点。

人类RI与ILK基因具有高度同源性，两者均定位于11号染色体短臂1区5带。前期研究发现RI与ILK蛋白在体内体外均能直接结合[3]。本研究亦发现，RI与ILK蛋白在膀胱癌EJ细胞中存在共定位现象，也提示两者存在直接结合与相互作用。本研究运用免疫荧光分析构建的稳转细胞系中RI与ILK的表达，上调RI抑制ILK的表达，而上调ILK显示出相反的结果。此外，本研究还发现，过表达ILK后膀胱癌细胞呈间质型形态，体内体外实验均显示上调ILK后膀胱癌的上皮标志物的表达降低，而间质标志物的表达增高，且过表达ILK的移植瘤呈现更强的自发性肺转移能力。而过表达RI抑制体内外EMT的发生，降低膀胱癌肺转移的能力。本结果均提示RI与ILK的相互作用表现为互相拮抗。本研究通过探讨RI与ILK相互作用发现其对膀胱癌EMT与转移的作用，并揭示潜在的分子机制，为RI作为膀胱癌诊断与治疗新的靶点提供理论依据。