许竞男

【摘 要】琼胶酶（Agarase）是一类可以水解琼胶和琼脂糖的糖苷水解酶。根据作用方式的不同，琼胶酶可以分为α-琼胶酶和β-琼胶酶。本文从琼胶酶的分布来源、酶学性质，应用等方面综述了琼胶酶的研究进展。

【关键词】琼胶酶；糖苷水解酶；综述

琼胶是红藻的主要成分，又称琼脂，是一种一种海洋粘性多糖。琼胶的有两种主要组成成分，分别是是琼脂糖（agarose）和硫琼脂（agaropectin）[1]。琼脂糖是琼胶的最主要的组成成分，它是由3，6-内醚-α-L-半乳糖和β- D -半乳糖通过α-1，3-糖苷键和β-1，4-糖苷件交替连接而成的线性多糖。琼胶酶（Agarase）是一类可以水解琼胶和琼脂糖的糖苷水解酶。

一、琼胶酶的分类方式

琼胶酶（Agarase）是一类可以水解琼胶和琼脂糖的糖苷水解酶。根据作用方式的不同，琼胶酶可以分为α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶（EC3.2.1.158）能够水解琼脂糖的α-1，3-糖苷键，所得的产物是琼寡糖（agarooligosaccharides）。β-琼胶酶（EC3.2.1.81）水解能够琼脂糖的β-1，4-糖苷键，所得的产物是新琼寡糖（neo-agarooligosaccharades） [2]。目前，有大量的β-琼胶酶被发现和报道。而α-琼胶酶只有几个。

琼胶酶的另一种分类方式是根据糖苷水解酶家族分类。它的分类依据主要是糖苷水解酶的氨基酸序列相似性，并且结合了三维结构、底物特异性和催化反应机制的相似性[3]。这种分类方式有利于反应糖苷水解酶的进化关系，对新发现的酶的分类有很好的预见作用。

根据上述分类方式，琼胶酶被划分在五个糖苷水解酶家族中。其中，β-琼胶酶分别被划分在GH-16、GH-50、GH-86和GH-118家族，而α-琼胶酶均被划分在GH-96家族。目前发现并报道的α-琼胶酶均归属于GH-96家族。

二、琼胶酶的来源及性质

琼胶酶的来源于微生物，这些微生物主要分布在海水[4-6]、海泥[7， 8]、海藻[9-11]、海螺[12]，海肠[13]等海洋软体动物体内，还有少量来源于淡水[14]、红树林沉积物[15]、动物和人体粪便[12， 16]等。细菌的种类广泛，包括革兰氏阴性菌，如太平洋火色杆菌[17]，嗜冷单胞菌[8]等。也包括革兰氏阳性细菌，如淡紫灰链霉菌[18]。

（一）野生β-琼胶酶的性质

目前，随着1902年第一个β-琼胶酶[7]，来自假单胞菌Pseudomonas galatica，被Groleau等发现并报道，人们陆陆续续发现了一系列β-琼胶酶，并进行了系统地深入研究。

在发现的野生β-琼胶酶中，酶活性的差别很大。自1992年，土壤来源细菌Acinetobacter sp. AGLSL-1 β-琼胶酶酶活达到397 U/ml[19]和1998年海洋来源的Pseudoalteromonas sp. β-琼胶酶酶活达到292 U/mL[10]，没有发现酶活更高的野生β-琼胶酶。

琼胶酶的底物琼脂糖具有胶凝性，在低于38℃的温度下，琼脂糖溶液会开始凝固，所以，大部分的琼胶酶的最适反应温度高于38℃。比如，来自Stenotrophomonas sp. Nta的嗜碱性琼胶酶[20]和来自Agarivorans gilvus WH0801的琼胶酶的最适反应温度为40℃。部分的β-琼胶酶最适反应温度特殊。来自来自Flammeovirga Sp. OC4.的β-琼胶酶Aga4436[17]的最适温度范围广泛，30-80℃；来源Bacillus sp. BI-3的耐热琼胶酶，最适反应温度高达70 ℃，在80 ℃是仍然保留最大酶活力的50%[21]；来自Gayadomonas joobiniege G7的琼胶酶Aga J9[22]的最适反应温度为25℃，在5℃的时候，仍能保留最大酶活的80%。

根据已经报道的β-琼胶酶相关文献，大部分的琼胶酶最适反应pH在6.5-7.5之间，pH接近中性。部分β-琼胶酶的最适反应pH比较特殊，来源Gayadomonas joobiniege G7的琼胶酶Aga J9[22]的最适反应pH为5；来源Stenotrophomonas sp. Nta的嗜碱性琼胶酶最适反应pH为10.0[20]；有的β-琼胶酶的pH耐受范围较广，来自Flammeovirga Sp. OC4.的β-琼胶酶Aga4436[17]最适pH在5-10，来源于Agarivorans sp. LQ48的琼胶酶AgaA，其最适反应pH在3.0-11.0之间[23]。

（二）野生α-琼胶酶的性质

相比较进行大量研究报道的β-琼胶酶，目前已经报道的α-琼胶酶仅有3例。1993年，法国人Potin等[4]从交替假单胞菌Altermonas agarlytics GJ1B中分离出第一个α-琼胶酶AgaA，SDS-PAGE电泳显示其分子量为180 kDa，Native-PAGE电泳显示其分子量约360 kDa，表明该酶存在二聚体现象产物为琼四糖。2005年，第二個α-琼胶酶AgaA33由Ohta等[8]自嗜冷单胞菌Thalassomonas sp. JAMB-A33里分离得到。SDS-PAGE电泳显示其分子量为85 kDa，但是其理论分子量为180 kDa，存在二聚体现象，降解终产物琼四糖。第三个α-琼胶酶AgaD[24]是于2017年报道的，分离自海洋细菌Thalassomonas sp. LD5。SDS-PAGE电泳显示其分子量为180 kDa，Native-PAGE电泳显示其分子量约360 kDa，也存在二聚体现象，最终产物为琼四糖。

（三）琼胶酶编码基因克隆及重组酶性质

目前，越来越多的琼胶酶被重组表达。最早有关琼胶酶重组表达报道是在1984年，是被表达在变铅青链霉菌中的[25]。1988年，来自Pseudomonas atlantica的琼胶酶被表达在大肠杆菌中。产量最大的重组酶是来海洋细菌JAMB-A94的β-琼胶酶[26]。它被表达在枯草芽孢杆菌中，通过发酵优化，产量达到81mg/ml。

三、瓊胶酶的应用

（一）琼胶酶在分子生物学中的应用

琼胶酶在分子生物学领域，常用来在琼脂糖凝胶回收过程中水解琼脂糖凝胶，回收目的核酸分子。1993年，Y Sugano等[27]用琼胶酶进行了胶回收DNA的研究。至今，琼胶酶在胶回收试验中的应用已经十分成熟。

（二）琼胶酶在水产养殖等工业方面的应用

琼胶酶可以用于获得海藻单细胞。在水产养殖业，单细胞生物是水生生物育苗期间常用的饵料。红藻细胞壁的主要成分是琼胶，通过琼胶酶制备海藻原生质体[28]。这个方法简单高效，有效提高单细胞生物饵料产量。

琼胶酶还可以用于生产生物乙醇[29]。由于海洋藻类不像木质纤维素那样难降解，应用到生物乙醇的生产过程中，可以有效提高生产效率。

（三）琼胶酶在制备琼胶寡糖方面的应用

近年来关于琼胶寡糖的研究越来越多，为琼胶寡糖的应用提供了越来越多的方向，带来了新的机遇。目前，琼胶酶制备的琼胶寡糖种类，稳定性，酶活越来越好，为琼胶寡糖的工业化应用打好了基础。

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