曾亚桐，张 怡，朱秋菊，童应凯

(天津农学院农学与资源环境生物技术系 天津300384)

0 引 言

随着人们生活水平的提高，人们对生活质量的提升要求迫切。豆粕是畜牧养殖业行业需求量相当大的蛋白原料。豆粕中的粗蛋白含量达到 43%～48%，而且由相对平衡的氨基酸组成，赖氨酸达 2.3%～2.5%[1]。但是相对于动物蛋白来讲，豆粕中的蛋白质含量较低，并且含有较多的抗营养因子，不利于动物消化吸收，从而影响豆粕的利用效率[2]。通过微生物混合发酵，将豆粕中的粗蛋白分解成小肽，可以大幅度提高豆粕的利用率。

枯草芽孢杆菌可产生大量的蛋白酶、淀粉酶等活性较高的酶，能够较好地水解大豆蛋白并降解豆粕中抗营养因子。芽孢杆菌有不易致死的芽孢，能够以活菌的状态进入动物肠道抑制有害菌的生长[3]。产朊假丝酵母可以分泌多种水解酶，有助于提高豆粕中蛋白含量，同时降低抗营养因子含量。通过枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母协同发酵，严格控制料水比，进行厌氧发酵。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母均为天津农学院生物技术系微生物实验室保存菌种，于2017年 9月获得。

1.1.2 培养基

菌种培养基：枯草芽孢杆菌——肉汤培养基产朊假丝酵母——YEPD固体培养基。

样品培养基：豆粕、微量元素、蒸馏水按照5∶1∶5的比例配置固体培养基，于 121,℃灭菌20,min。

1.1.3 其他药品

微量元素配比，硫酸镁、葡萄糖、磷酸二氢钾按照100,mL中0.001%∶0.1%∶0.5%,进行调配。

淀粉酶活力和糖化酶活力测定所需药品：pH值为 6.9磷酸钠缓冲液、1%,淀粉溶液、3，5-二硝基水杨酸显色剂、麦芽糖标准液。

蛋白酶活力测定所需药品：pH值为 3.5乳酸缓冲液、pH值为 7.0磷酸缓冲液、pH值为 9.9碳酸缓冲液、1%,干酪素、0.4,mol/L三氯乙酸、Folin试剂、0.4,mol/L碳酸钠。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的准备

各取一环枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母分别接种到肉汤固体培养基和 YEPD固体培养基上，并分别置于32,℃培养72,h。

1.2.2 样品的制备

将培养好的菌种制成菌悬液，每 10,g培养基中接种0.5,mL菌悬液，隔12,h取一次样测其酶活力。

样品1：加入0.5,mL枯草芽孢杆菌菌悬液；

样品2：加入0.5,mL产朊假丝酵母菌悬液；

样品3：加入 0.25,mL枯草芽孢杆菌菌悬液和0.25,mL产朊假丝酵母菌悬液。

1.2.3 糖化酶活力和淀粉酶活力的测定

1.2.3.1 样品处理

分别称取1,g样品1、2、3放于离心管中并标记，每管加入 20,mL、pH值为 6.9磷酸钠缓冲液，3,000,r/min离心10,min，取上清液。

1.2.3.2 淀粉酶测定步骤

取7支试管，按照表1操作。

表1 淀粉酶活力测定方法Tab.1 Amylase activity assay method

1.2.3.3α-淀粉酶活力的测定

将提取酶液置于 70,℃水浴加热 15,min钝化 β-淀粉酶后，按照表1进行操作。

1.2.4 蛋白酶活力测定

1.2.4.1 样品处理

样品1、2、3各称取3份1,g样品置于离心管中，用于检测3种样品的酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力、碱性蛋白酶活力。酸性蛋白酶检测样品中加入20,mL、pH 值为 3.5的乳酸缓冲液，于 40,℃水浴0.5,h；中性蛋白酶检测样品中加入 20,mL、pH 值为7.0磷酸盐缓冲液，于30,℃水浴0.5,h；碱性蛋白酶检测样品中加入20,mL、pH值为9.9的碳酸盐缓冲液，于 22,℃水浴 0.5,h。处理后样品3,000,r/min离心10,min，分别取上清液[4-5]。

1.2.4.2 测定步骤

分别取 1,mL待测酶液于样品管中，相应温度预热 5,min，加入相应温度的 1%,干酪素 1,mL，并于相应温度反应20,min。迅速取出加入2,mL 0.4,mol/L的三氯乙酸终止反应，沉淀过量底物10,min过滤，取反应液1,mL，加入5,mL 0.4,mol/L的碳酸钠溶液，加入1,mL 福林-酚试剂，摇匀，40,℃水浴 20,min，在660,nm波长下比色并记录。

空白测定，另取一空白管，加入 2,mL 0.4,mol/L的三氯乙酸，再加入1,mL 2%,酪蛋白溶液，40,℃沉淀完全后加入1,mL酶液，其余操作同上，得空白A660[6]。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶活力测定结果

2.1.1 干酪素标准曲线

以干酪素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制得干酪素标准曲线，计算出样品中蛋白酶含量，标准曲线结果如图1所示。

图1 干酪素标准曲线Fig.1 Casein standard curve

2.1.2 碱性蛋白酶活力测定结果

测定3种样品的碱性蛋白酶活力，从而得出添加不同菌种对发酵体系碱性蛋白酶活力的影响，其测定结果如图2所示。

图2 碱性蛋白酶活力Fig.2 Alkaline protease activity

图2 中产朊假丝酵母发酵豆粕的碱性蛋白酶活力相对于其他两组最小，前 36,h比较平稳，36～48,h酶活力开始上升，由于微生物大量繁殖产生大量CO2，抑制酵母生长，48～60,h酶活力降低，60,h后无氧呼吸产生的丙酮酸与 CO2结合生成草酰乙酸，促进蛋白酶活性增长，72,h上升至最大值 314.4,μg/g；枯草芽孢杆菌单菌发酵前 36,h一直处于上升趋势，由于微生物生长繁殖产生大量CO2，抑制细菌继续生长甚至部分细菌死亡，36,h后酶活力下降，48,h后CO2促进中间体的合成酶活力又开始上升，72,h后酶活力达最大值 498,μg/g；混合菌种发酵从发酵开始酶活力一直处于上升趋势，发酵 60,h酶活力达到最大值726,μg /g后开始降低。综上所述，混合菌种发酵豆粕的碱性蛋白酶活力最强。

2.1.3 中性蛋白酶活力测定结果

测定3种样品的中性蛋白酶活力，判断添加不同菌种对发酵体系中性蛋白酶活力的影响，其测定结果如图3所示。

图3 中性蛋白酶活力Fig.3 Neutral protease activity

由图3可以看出产朊假丝酵母发酵豆粕前 24,h酵母大量增殖，中性蛋白酶活力处于上升趋势，24,h后 CO2浓度增加，抑制菌体生长酶活力开始下降，60,h后其他酶水解底物提供大量能量和前体，促进蛋白酶合成，酶活力上升，72,h达到最大值235.2,μg/g；枯草芽孢杆菌发酵前 48,h细菌进行大量增殖，酶活性为上升状态且达到最大值 385.2,μg/g，48,h后 CO2浓度增加，抑制细菌增长酶活力开始下降；混合菌种发酵从总体上来看一直处于上升状态，酶活力在24～36,h下降后又开始上升。总体来讲，3组发酵中混合菌种发酵效果较两种单菌发酵效果更明显，且酶活性值最大。

2.1.4 酸性蛋白酶活力测定

测定3种样品的酸性蛋白酶活力，判断添加不同菌种对发酵体系酸性蛋白酶活力的影响，其测定结果如图4所示。

图4 酸性蛋白酶活力Fig.4 Acid protease activity

由图4可知，枯草芽孢杆菌发酵豆粕一直呈上升状态，前48,h酸性蛋白酶活力增长缓慢，48,h后酶活力上升趋势明显；产朊假丝酵母发酵 24,h前酶活力逐渐降低，24,h后开始上升至 48,h最大值391.2,μg/g，然后开始急剧下降，可能是由于酵母增长繁殖，产生热量，培养基温度高于外界恒定培养温度，导致大部分菌体死亡；混合菌种发酵前24,h酶活力呈上升趋势，24～60,h由于菌体大量增殖释放CO2和热量，抑制菌体生长，酶活力迅速降低，60,h后可能因为其他酶的协同作用，促进蛋白酶活力上升，72,h达到最高点 440.4,μg/g。总体来说，虽然混合菌种发酵波动较大，但是混合菌种发酵两次达到相对最大值，所以混合菌种发酵豆粕产酸性蛋白酶活力表现较好。

2.2 糖化酶活力测定结果

2.2.1 麦芽糖标准曲线

以麦芽糖浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(Abs)为纵坐标，麦芽糖标准曲线用于糖化酶和淀粉酶含量的测定，结果如图5所示。

2.2.2 糖化酶活性

以 3，5-二硝基水杨酸为显色剂紫外分光光度法测定3种样品的糖化酶活力，结果如图6所示。

图6 糖化酶活力Fig.6 Glucoamylase activity

由图6可知，产朊假丝酵母发酵豆柏糖化酶活力随时间的增加酶活性逐渐升高，48,h之后酶活性增长平缓。枯草芽孢杆菌发酵豆粕，前36,h大量增殖酶活力逐渐上升，36,h后CO2抑制细菌的生长，酶活性开始降低，60,h大量的CO2促进草酰氨乙酸合成，酶活力上升，72,h达到最大值 779.596 6,U/mg；混合菌种发酵豆粕前24,h糖化酶活性上升，菌种大量增殖，产生CO2，24～48,h进行无氧呼吸，细菌中PEP羧化酶和酵母中丙酮酸羧化酶与 CO2结合，生成大量草酰乙酸，促进氨基酸前体与蛋白质合成[7]，60,h糖化酶活性达到最大值 806.646 7,U/mg。综上所述，混合菌种发酵豆粕的糖化酶活力最强。

2.2.3 α-淀粉酶活性的测定

测定 3种样品的 α-淀粉酶活力，判断添加不同菌种对发酵体系α-淀粉酶活力的影响，其测定结果如图7所示。

图7α-淀粉酶活力Fig.7 Alpha-amylase activity

由图7可知，枯草芽孢杆菌发酵期间，36～60,hα-淀粉酶活性最低，可能是因为菌体增殖后产生的CO2和热量影响了蛋白酶酶活性，60,h后酶活性增强，可能是其他酶的协同作用，在 72,h达到最大值；产朊假丝酵母发酵期间，前36,h酶活力迅速上升，酵母大量增殖，36～72,h酶活力上升缓慢并在 72,h达到最大值748.560 2,U/g；混合菌种发酵期间，前36,h酶活力上升缓慢，在 24,h和 60,h都出现高峰值，36～48,h酶活力减弱，可能是由于细胞呼吸作用产生大量 CO2和热量，抑制了细胞的生长，48～60,h酶活力增强，可能是因为细胞中 NH4+与培养基中 K+结合，激活α-淀粉酶[7-8]，24,h达到最大值 762.84,U/g，整体高于2种单菌发酵值，说明枯草芽孢杆菌产生的α-淀粉酶活力增强了产朊假丝酵母的α-淀粉酶活力。

2.2.4 β-淀粉酶活力测定

计算 3种样品的 β-淀粉酶活力，判断添加不同菌种对发酵体系β-淀粉酶活力的影响，其结果如图8所示。

图8 β-淀粉酶活力Fig.8 β-amylase activity

由图8可知，枯草芽孢杆菌发酵前 24,h迅速上升至酶活力最大值 32.063 5,U/g，24～48,h酶活力下降，48～60,h上升后再次下降；产朊假丝酵母发酵在12,h下降，36,h上升，48,h后下降，60,h后酶活力趋近于平稳；混合菌种发酵在 24,h酶活力达到最大值49.225 1,U/g后开始下降，60,h后上升。枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母单菌发酵，酶活性都出现了上升后下降再上升的走势，第一次酶活力降低可能由于细胞增殖产热，抑制菌体生长，第二次酶活力增强可能是培养基内的Mg2+增强了β-淀粉酶活力[8]。综合来讲，混合菌种发酵酶活力相对最强。

3 讨 论

①豆粕主要以粗蛋白为主。所以发酵豆粕要以降解粗蛋白为主要目的，通过对蛋白酶活力测定，可以确定降解粗蛋白的时间。混合菌种发酵 60～72,h之间蛋白酶活性比较强。

除了粗蛋白，豆粕中含有一定的糖类物质，通过对淀粉酶活力的测定，混合菌种发酵 24,h淀粉酶活性比较强。综合比较发现，混菌发酵体系中，糖类物质会先一步被分解，然后再逐步分解蛋白质。

②枯草芽孢杆菌中有 PEP羧化酶，而产朊假丝酵母有丙酮酸羧化酶，二者均可以与 CO2结合产生草酰乙酸，促进氨基酸代谢，从而促进胞内蛋白的合成，所以混合发酵中枯草芽孢杆菌对产朊假丝酵母发酵具有协同作用。

4 结 论

在一定培养时间范围内，枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母混合发酵具有协同作用，通过分别测定蛋白酶和糖化酶活力，显示枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母混合菌种发酵效果最好，发酵 60～72,h其蛋白酶活力最高，发酵24,h其淀粉酶活力最高。