陈长春 周勤 尹晓娟

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有多向分化和自我更新功能，目前NSCs治疗神经系统退行性疾病主要采用NSCs移植和诱导自身的NSCs增殖分化两种方法[1-2]。人类采用NSCs治疗的疾病越来越多，基础研究采用动物和细胞模型模拟人类缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)进行模式研究，目前，有很多建立缺氧NSCs模型的方法[3-4]，但由于不同的研究单位条件不同，有些方法对设备要求高，造价也高，因而不能普遍实用。若能寻找一种要求的设备简单、成本又低、操作简单而有效方法，那将是人类的福气。为此，本研究采用细胞培养及自制缺氧盒等技术，建立新生鼠(sprague dawley，SD)的NSCs缺氧细胞模型，旨在为开展NSCs与HIBD的相关研究提供新思路。

材料与方法

1.材料：健康新生1 d体重分别为8 g、9 g的SD大鼠2只，雌雄不限，购自中国人民解放军军事医学科学院(SCXK-(军)-2012-0004)。95% N2+ 5% CO2的混合气体(北京兆格气体科技有限公司)，兔抗大鼠Nestin单克隆抗体(Santa)、表皮生长因子(EGF)、N2、新生的小牛血清(GibcoBRL)、B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、细胞培养基DMEM/F12，SP通用抗体试剂盒，DAB试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)由碧云天公司提供，DMEM无糖培养基(Neuronbc)，其它试剂为国产分析纯；乐扣矩形保鲜盒(HPL825-CHM)，二氧化碳培养箱(SANYO，MCO-18AIC)，迷你离心机(昊诺斯生物科技有限公司，10512425)，摇床(其林贝尔，TS-1000)。

2.方法：

(1)分离SD乳鼠的海马组织。SD鼠用乙醚麻醉，脱颈处死，放入75%乙醇中浸泡消毒，移至超净工作台上，取出海马，将海马组织移入另一只冰浴的盛有D-hank′s液的平皿剪碎吹打，用200目钢丝网过筛，至10 ml试管中，加入0.25%的胰蛋白酶3 ml，放入37℃水浴箱水浴5 min，消化并充分吹打，用胎牛血清终止消化，以1 000 r/min转速，离心8 min，去除上清，留取管底白色沉淀物，即单细胞悬液，台盼蓝活细胞计数。……