耿 琦， 余 洋， 刘绒梅， 田圆圆， 李玺洋，梁鹏宽， 石海春， 柯永培， 孙 群

(1. 四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都 610064;2. 四川农业大学农学院，四川 成都 611130)

0 引 言

玉米（Zea maysL.）属禾本科玉蜀黍属，是一种世界性重要作物。玉米灰斑病是一种由尾孢菌引起的玉米植株真菌病害，最早于20世纪20年代在美国伊利诺斯州和亚历山大州被发现[1]，在国内于20世纪90年代在东北首次发现[2]，目前该病已严重影响我国的玉米产量（最高减产100%）及青贮玉米的质量[3]。研究表明，相对低的温度（20～25 ℃）与高湿的天气有利于该病的发生及传播[4-5]，而我国西南地区气候湿度较大。同时，西南地区常见玉米栽培品种正红532优质高产，抗倒伏，但对玉米灰斑病表现为高感；正红311果穗粗大、抗旱耐瘠、为山地骨干品种，也是四川省农业厅连续3年主导品种，然而对玉米灰斑病表现为感病。因而开展玉米灰斑病的综合防治具有重要意义。

目前，对玉米灰斑病的防治方法有种植抗病品种，或采取翻耕、套种、轮作、间作种植等物理措施及喷施化学药剂[6]。抗病品种培育周期较长，且由于病原菌菌株的多样性，抗病品种具有地域局限性。物理措施比较费时费力，而化学农药喷施效果虽好，但在环境中有残留，不易降解，且病原菌易产生抗性。植物病害的生物防控研究日益兴起，对于玉米的一些病害或其他作物的灰斑病的防控研究已取得一定进展，如利用芽孢杆菌防治玉米大斑病[7]、荧光假单胞菌防治玉米纹枯病[8]、哈茨木霉防治玉米茎腐病[9]以及利用芽孢杆菌防治黑麦草灰斑病等[10]。现已有用于玉米的微生物种衣剂（AcceleronB -300SAT），可促进植物吸收营养、提高作物产量[11]，但尚未发现防治玉米灰斑病的生防制剂上市。

前期研究发现淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）S3-5对玉米灰斑病病原菌玉蜀黍尾孢菌（Cercospora zeae-maydisTehon & Daniels）有抑制作用，抑菌圈直径达15 mm[12]。孢子作为S3-5的繁殖体，与菌丝相比，更易获得，抗逆性更强，故以孢子为S3-5的使用形式。本研究利用正红532、正红311两个品种进行田间试验，通过喷施S3-5孢子悬液，探究其在田间防治玉米灰斑病的效果。由于孢子贮存或施用到田间时会受到温度的影响，存活率下降，且田间环境中的紫外线会对孢子具有一定的杀伤作用，影响其萌发[13-14]，所以本文通过对稳定剂、紫外保护剂进行筛选，提高S3-5孢子的存活率，延长制剂的效用时间，以增强S3-5在田间防治玉米灰斑病的效果，为S3-5生防制剂规模化生产及应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）S3-5，为实验室保藏菌株。

1.1.2 试剂

稳定剂：蔗糖（天津博迪化工股份有限公司），甲基纤维素（成都化夏化学试剂有限公司，100 000 mPa·s），海藻糖（成都金裕生物科技有限公司），乳糖（成都市科龙化工试剂厂），PEG 200（成都化夏化学试剂有限公司）；均121 ℃，15 min高压蒸汽灭菌。

紫外保护剂：高岭土（上海五四化学试剂厂），蒙脱石（蒙脱石散，博福-益普生（天津）制药有限公司），维生素C（山西太原药业有限公司），异维C钠（源叶生物，98%）；维生素C和异维C钠0.22 μm水相滤膜过滤除菌，其余试剂121 ℃，15 min高压蒸汽灭菌。

玉米种子：正红532、正红311，为四川农大正红生物技术有限责任公司提供。

农药：氟硅唑（兴农帅星，有效成分含量400 g/L，乳油，兴农药业（中国）有限公司）。

燕麦片琼脂培养基(ISP3)：燕麦20 g，MnCl2·4H2O 0.001 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.3 仪器

艾科浦超纯水机（重庆颐洋企业发展有限公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；SL-N电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；ESJ电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；生物安全柜（青岛海尔特种电器有限公司）；洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；UV-C紫外灯（Philips，TUV 8W G8 T5，made in Poland，253.7 nm）；Olympus BX53 显微镜。

1.2 方法

1.2.1 淡紫灰链霉菌S3-5孢子悬液的制备

将S3-5接种在ISP3培养基上，28 ℃培养7 d后，用无菌水进行冲洗，得到S3-5孢子悬液。

1.2.2 田间试验

2016年于四川省广元市朝天区曾家镇（自然发病区）进行田间试验，以探究S3-5孢子悬液对玉米灰斑病的防效。以喷施广谱杀菌且渗透性强的内吸性杀菌剂氟硅唑为阳性对照，以喷施海藻糖溶液为阴性对照。具体时间安排为：4月初进行玉米的播种，4月20日左右进行玉米植株的移栽，6月25日（小喇叭口期与大喇叭口期之间）对阴性对照组和2组处理组进行处理，7月3日（接近开花期）对阴性对照组、喷施2次S3-5孢子悬液的处理组及阳性对照组进行处理，自然发病，9月10日左右（乳熟期）进行病情统计。喷施药液时力度较轻，尽量避免其飘散到相邻植株。具体各组情况如表1所示。

表1 田间试验分组1）

参考相关文献[5, 15-17]，统计病情时采用方法如下：

1）从田间各组随机选取5株植株作为样本，采集其穗上、穗中、穗下3片叶子进行拍照统计。使用Adobe Photoshop CS6 软件对玉米叶片的病斑相对面积进行测量。参照表2，根据之前得到的叶片病斑面积占叶片总面积的比例来对每片叶片进行病情分级，并计算田间各组病情指数及防治率。

表2 玉米灰斑病病级严重度分级标准1)-2)

2）根据各组发病程度及病情指数确定其抗性水平，具体的划分标准如表3所示。

表3 病情指数对应抗性水平衡量标准

3）根据每组植株上叶片病斑占比，进行组间差异显著性的分析。

1.2.3 稳定剂筛选

参照相关文献[18-21]，选择表4中各物质作为稳定剂。参考企业标准信息公共服务平台上成都普特生物科技股份有限公司开展热贮稳定性试验的方法。

将各稳定剂溶液与S3-5孢子悬液进行混合，得到含不同稳定剂的S3-5孢子悬液（105～106CFU/mL），各组稳定剂终浓度如表4所示。每组3个平行，每个平行取5 mL含稳定剂的S3-5孢子悬液至10 mL离心管中，37 ℃遮光静置处理，分别在第7 d、14 d取样进行稀释涂布，28 ℃培养2 d进行计数，以第0 d结果作为空白组，计算各时间点下各组S3-5孢子的存活率。同时以不含稳定剂的S3-5孢子悬液作为对照，观察各稳定剂对S3-5孢子的保护作用，筛选出最佳保护剂。

表4 稳定剂种类及含量

1.2.4 紫外保护剂筛选

参照相关文献[22-24]，选择表5中各物质作为紫外保护剂，参考文献方法[22-23]进行紫外保护剂筛选，在长136.5 cm的操作台上进行试验。操作台左右两端上空各装备一支紫外灯用于照射（两灯均距水平台面41.5 cm，距操作台内侧壁2.5 cm，至操作台中央等距）。分别取含各种紫外保护剂的S3-5孢子悬液（105～106CFU/mL）8 mL于9 cm培养皿盖上，放置培养皿盖于操作台中央，每组3个平行。静置紫外照射10 min，每隔5 min取样一次。将各组样品进行稀释涂布，28 ℃培养2 d后进行菌落计数。以不经紫外照射的S3-5孢子悬液作为空白组，计算存活率。此外，以不含紫外保护剂的S3-5孢子悬液作为对照，以观察各紫外保护剂对S3-5的紫外保护作用，筛选出最佳保护剂。

表5 紫外保护剂种类及含量

2 结果

2.1 田间试验

如表6所示，喷施S3-5孢子悬液对正红311上玉米灰斑病具有一定的防效，可将病情指数从高感水平降低到感病水平，其中：喷施1次可将灰斑病的病斑占比由72.24%降至62.93%，将病情指数由86.67%降至77.33%；而喷施2次可将灰斑病的病斑占比降至51.10%，将病情指数降至70.67%，且喷施两次效果显著（P<0.05）。但喷施S3-5孢子悬液对正红532上玉米灰斑病的病斑占比及病情指数无影响。

表6 各组病斑占比及病情指数1）%

如表7所示，喷S3-5孢子悬液对正红311上的玉米灰斑病有一定防效，其中喷施1次及2次的防治率分别为10.78%、18.46%。表明菌株S3-5在田间对玉米灰斑病具有防治作用，可优化出相应助剂。喷施S3-5孢子悬液在正红532上未见效果，这可能是因为正红532为高感品种，其发病情况过于严重，所有处理包括阳性药物均未见效。

表7 田间试验处理组及阳性对照组防治率

2.2 稳定剂筛选

如图1所示，随着处理时间的推移，各组S3-5孢子的存活率均有所下降。在第14 d，PEG 200组和甲基纤维素组的存活率较高，其中甲基纤维素组的存活率达到95.82%，PEG 200组的存活率达到46.04%，而乳糖、蔗糖、海藻糖组S3-5孢子存活率均非常低。甲基纤维素组在第7 d及第14 d孢子存活率与对照组差异显著（P<0.05）。综上，最佳稳定剂为2.5%甲基纤维素。

图1 不同稳定剂对S3-5的保护

2.3 紫外保护剂筛选

如图2所示，随着紫外处理时间的增加，各组S3-5孢子的存活率均有不同程度的下降。在紫外处理10 min后，高岭土、蒙脱石组存活率低于10%，而异维C钠和维生素C存活率较高，均高于70%；且在紫外处理第5 min和第10 min，异维C钠和维生素C组S3-5的存活率均与对照组在这两个时间点的存活率差异显著（P<0.05）。考虑到保护效果及成本问题，故最佳紫外保护剂为0.3%异维C钠。

图2 不同紫外保护剂对S3-5的保护

3 结束语

现在对于植物病害的防治一般采用化学农药，同时已有苏云金杆菌、芽孢杆菌、哈茨木霉等相关微生物农药上市售卖。从短期来看，微生物农药与化学农药相比，虽然防效不及化学农药，且施用时受到的影响因素较多，但可作为一种补充的方法。本研究中田间试验表明喷施淡紫灰链霉菌S3-5孢子悬液对正红311上玉米灰斑病具有一定的减轻效果，且喷施两次效果显著（P<0.05）。说明S3-5施用于田间对玉米灰斑病是有一定作用的，后续研究我们可以考虑将S3-5制剂与相容性较好的化学农药混用，这样可以从一定程度上减少化学农药的使用，使农业生产中产生的污染更小，使病原菌产生抗药性几率更低。

生防菌在田间的存活情况影响生防制剂在田间的防效。本文中生防菌淡紫灰链霉菌S3-5分离于玉米田中，故适应于玉米周围的环境。将生防菌喷洒于田间，其生存将会受到诸如干燥、紫外、降水等因素的影响[23]，而在运输过程中生防制剂也会受到温度等的影响。本文中筛选出了0.3%异维C钠作为紫外保护剂，2.5%甲基纤维素作为稳定剂，在菌株抗紫外、抗高温、贮存方面进行了探究。后续还需通过正交试验等方法来确定稳定剂和紫外保护剂的最佳浓度，并探究如何在田间恶劣环境下提供营养从而加快S3-5孢子萌发、提高存活等问题，从而提高S3-5生防制剂的效用。

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