王京，张明赞

（贵州工业职业技术学院，贵州贵阳550025）

猪肉含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、铁、磷等成分，具有补虚强身、滋阴润燥及丰肌泽肤的作用，是我国和国外日常生活主要的肉类食品之一[1]。冷却猪肉又称冷鲜猪肉，是猪肉宰后使胴体深沉温度在24 h内降至0℃～4℃，并保持在该温度下贮藏的一类肉品。冷却猪肉口感细腻，鲜美，具有很高的营养价值，代表了猪肉产业的消费和生产发展方向[2]。但是如何有效抑制冷却猪肉在生产、运输和贮藏过程中微生物的生长繁殖过程，防止产品的腐败变质，一直困扰着生产者。目前常使用微生物预测来快速评估冷藏猪肉的货架寿命和安全性，极少使用传统的分析测试。冷却猪肉具有较强的水分活性和丰富的营养，使得微生物成为肉类腐败的主要原因。在低温贮藏条件下，假单胞菌是肉类的主要腐败物之一，严重影响猪肉品质[3]。因此，越来越多的消费者更加关注在预测冷却猪肉货架期方面的研究。

通过大量对引起冷却猪肉腐败变质因素的研究，国内外学者得出其主要影响因素是假单胞菌和肉类的储存温度。假单胞菌是能引起冷却肉类腐败变质的主要微生物之一[4-5]，假单胞菌属占肉类腐败微生物的25%～26%，是需氧菌，在有氧条件下生长，具有致腐的特性。田璐等[6]指出，在有氧条件下需氧型假单胞菌大量繁殖引起冷却肉腐败，繁殖能力与假单胞菌有较强的利用肌氨酸的能力有关[7]。假单胞菌的生长需要足够碳源与能源，在适宜的条件下，假单胞菌生长达到一定数量时，冷却猪肉中碳源不能满足其生长生理的需求，随后假单胞菌就会利用冷却猪肉的氨基酸作为生长营养基质，肉类的氨基酸分解利用将会产生一些带有异味的物质，如含硫化合物、酯、酸等。实际上，肉类的腐败及货架期寿命主要取决于肉类中假单胞菌的生理行为，表现在假单胞菌新陈代谢产物的利用或是吸收的大幅度正面或是负面的影响[8]。贮藏所处环境温度也是影响冷却猪肉货架期长短的重要因素[9-10]，由于国内外冷链系统不完善，肉类储运管理不当，尤其是冷冻猪肉库存和温度波动较大。在实际冷藏储存和销售过程中，温度高，猪肉中的微生物迅速繁殖，影响猪肉产品的安全。

从现有的研究来看，通过预测变温条件下微生物的生长，对肉的保质期研究知之甚少，冷却猪肉的保质期还处于起步阶段。因此，在对微生物生长繁殖进行试验分析的基础上，建立了猪肉微生物冷却不同温度的预测模型，研究腐败猪肉的微生物生长情况，为评价和控制肉品质量提供理论依据。

1 材料与方法

建立冷却猪肉货架期预测模型，以此来证实假单胞菌为变温条件下冷却猪肉的特定腐败菌[11-13]，将冷却猪肉分别置于 0、5、10、15、20、25 ℃条件下，进行假单胞菌活菌与菌落总数计数，并测定假单胞菌数量、挥发性盐基氮值、色差L*值及感官评定分值等品质指标。

1.1 材料与仪器

根据GB/T 22289-2008《冷却猪肉加工技术要求》，每次随机选取10条常规屠宰分割的猪臀肉，冷藏（0～4℃）条件下2 h内带回实验室。

假单胞菌培养基：蛋白胨16.0 g；水解酪蛋白10.0 g；无水硫酸钾10.0 g；氯化镁1.4 g；甘油10.0 mL；假单胞菌培养基选择剂C-F-C（OXOID，英国）1支/200 mL；培养基的pH值调节为7.0±0.2；蒸馏水1000 mL。

平板计数培养基（plate count agar，PCA）：胰蛋白胨5.0 g；酵母浸粉2.5 g；葡萄糖琼脂15.0 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0±0.2。

SPX-400型智能型生化培养箱：上海科恒实业发展有限公司；JM-A2002电子天平：余姚记铭称量股份有限公司；SW-CJ-10超净工作台：苏州净化有限公司；BCD-278TAJ低温冰箱：青岛海尔股份有限公司；pH S-3C pH计、JM-AI5002便携式色差仪：余姚市红铭称重校验设备公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离与筛选、样品处理

菌种分离与筛选：称取5.0 g冷却猪肉，加入到50 mL无菌生理盐水中，再加入4颗小玻璃珠，37℃、180 r/min振荡培养30 min，吸取5 mL振荡后溶液加入富集培养基（250 mL三角瓶装液量为50 mL）中，37℃、180 r/min摇床富集培养24 h。取0.2 mL稀释适当梯度的富集悬浮液涂布于酪蛋白平板培养基上，静置5 min后，倒置平板放于37℃培养箱培养24 h。将形成单一菌落，划线纯化后划Z形线保藏于斜面培养基上，37℃条件下培养1 d或2 d直到斜面出现丰满的菌落后，放于4℃冰箱保藏，菌株编号为JXJ。

利用传统的菌种鉴定方法如菌落特征、形态特征、生理生化特征[17]和16S rRNA、recA基因序列分析对菌种进行准确的分类鉴定，采用MEGA5.0生物学软件构建系统进化树，采用邻近相连算法（Neighborjoining）对该菌株的16S rRNA序列进行分析，在树枝上标记重复1000次，自展检验Bootstrap值，从而确定菌株的亲缘关系和分类地位[18]。

样品处理：从贵阳市花溪区星力超市采样，每次随机选取10条常规屠宰分割的猪臀肉，冷藏（0℃～4℃）条件下2 h内带回实验室。将猪臀肉于超净工作台分割成50 g左右大小，悬浮于80℃无菌水中10 s进行灭菌。经培养计数，菌落总数＜102（CFU/mL），灭菌效果较好。菌悬液经适当稀释，将灭菌后肉样浸入菌悬液中20 s接种。使接种后肉样初始接种量为103CFU/g，接种后沥干菌液于无菌密封袋中，分别置于0、5、10、15、20、25℃低温恒温水浴槽中贮藏，温度波动±0.1℃。

1.2.2 指标的测定

菌落总数、假单胞菌数的测定：在无菌操作环境下，每隔相应时间段取每组样品（3个肉样组成）相应肉样25 g置于锥形瓶中，加入225 mL无菌生理盐水中并密封好，用摇床摇1 h左右，然后按10倍稀释梯度，每个稀释度取100 μL样液涂布于培养基表面，共取3个稀释度，每个稀释度做3个重复，进行假单胞菌数的测定，细菌总数的测定按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行。

挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）的测定：在规定的时间段，取猪肉样10 g绞碎搅匀，置于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水备用。按GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》微量扩散法测定挥发性盐基氮含量。

色差的测定：每隔相应时间取相应肉样用便携式色差仪测色差L*值，每个样品至少测定3次，取平均值。

感官评定：10位专家组成感官评价小组，对肉的气味，颜色，黏度，质地，肉汤进行综合评价。使用相对简单的7分制，得分1表示最好的猪肉质量，得分7表示腐败猪肉，这是可接受的界限，当评分人数半数以上的评价或以上时，即为感官拒绝点，评定方法按GB/T 22289-2008《冷却猪肉加工技术要求》执行。

pH值的测定：每隔相应时间取猪肉样品10 g绞碎搅匀，放于盛有100 mL灭菌后蒸馏水的锥形瓶中，摇床振荡静置30 min后过滤，测定滤液的pH值。滤液用于TVB-N的测定。

1.2.3 数据处理与统计分析

本试验数据采用SPSS 20.0，OriginPro9.0软件进行分析，各指标数据采用SPSS 20.0统计软件进行相关分析和聚类分析，采用OriginPro9.0，Matlab7.0软件进行模型拟合和回归分析。

2 试验结果与分析

2.1 菌落与细胞形态

菌株JXJ的平板菌落形态如图1。

图1 菌株JXJ的平板菌落形态Fig.1 Colonies of the JXJ on bacterial medium

在假单胞菌培养基上菌落生长较快，菌落特征明显，呈淡黄色半透明，近圆形，边缘齐整，光滑稍隆起，菌落直径1.5 mm～3.0 mm，其生理生化特征见表1。

表1 JXJ生理生化特征—碳源利用Table 1 Physiological and biochemical characteristics（utilization of carbon sources）of the strain JXJ

经软件比对该株菌株与荧光假单胞菌（P.fluorescens）特征接近。根据以上形态及生理生化特征可知菌株JXJ的特征符合假单胞杆菌属，初步鉴定它属假单胞菌属（Pseudomonas）。

将JXJ菌株的全部16S rRNA序列分别提交到NCBI，通过Blast在线程序在GenBank数据库中检索与已刊登的16S rRNA序列同源性进行比较，下载同源性较高的菌株的序列，采用软件MEGA 5.0对其进行分析，采用邻近法构建系统树，并且Bootstrap1000次检验分子系统树置信度获得系统发育树（见图2）。

由系统发育树可知，菌株JXJ形态特征和生理生化特征接近荧光假单胞菌属，菌株JXJ的16S rRNA序列与Pseudomonas sp.HY13KR序列同源性在99%以上，可进一步说明菌株JXJ为假单胞菌属。

2.2 假单胞菌与各品质指标的相关性分析

冷却猪肉在4℃贮藏下各品质指标的皮尔逊相关系数见表2。表2所示的结果，猪肉在4℃贮藏期间，假单胞菌数量与色差L*值、感官评价分值、菌落总数、pH值及挥发性盐基氮（TVB-N）的相关系数分别为-0.897（p＜0.01）、0.984（p＜0.01）、0.987（p＜0.01）、0.723（p＜0.01）、0.885（p＜0.01），差异均极显著（p＜0.01），两两高度相关。

图2 基于JXJ的部分16S rRNA序列同源性构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree on the similarity of partial 16S rRNA sequence of the strain JXJ

表2 冷却猪肉在4℃贮藏下各品质指标的皮尔逊相关系数Table 2 Pearson correlation coefficient of quality characteristics of chilled prok stored at 4℃

从表2可知，假单胞菌的生长与猪肉在4℃贮藏期间的细菌总数、TVB-N及色差L*值等多种品质指标均显著相关，并且假单胞菌菌落总数与腐败指数之间的相关系数大于其他指标的相关系数，从而确定属于冷冻猪肉的假单胞菌的特征，利用生长模型预测好氧贮藏条件下冷冻猪肉腐败程度。

2.3 假单胞菌的腐败限控量的确定

为确定猪肉中假单胞菌的腐败限量，选用假单胞菌总数、细菌总数、TVB-N值、色差L*值及感官评定值作为冷却猪肉不可接受的判断指标，通过SPSS 20.0统计软件对各测定指标数据进行分析及Origin－Pro9.0软件进行聚类分析，则可得表3及图4所示的结果。

表3 4℃贮藏冷却猪肉各品质指标（平均值+标准差）Table 3 Quality characteristics of chilled pork stored at 4 ℃（Mean±SD）

由表3可看出：假单胞菌的数量和菌落总数随时间增加，假单胞菌的生长在第8天显着增加为假单胞菌生长的延滞期和对数生长期，8天之后基本处于稳定期；随着贮藏时间的变化，猪肉的pH值缓慢增加，可看出在贮藏第8天时pH值达到6.30；TVB-N值在贮藏的前8天变化不大，基本保持在7 mg/100 g左右，但到了第10天数值升至16.87 mg/100 g，超过GB2707-2016《食品安全国家标准鲜（冻）畜、禽产品》鲜（冻）肉中TVB-N值≤15 mg/100 g的标准，与前8天的数值差异显著（p＜0.05）；色差L*值描述肉的亮暗程度，贮藏初期肉的颜色变化不是很大，基本处于39左右，但是到了8天之后颜色亮度值直线下降，第10天的数值与前8天差异显著（p＜0.05）；感官评定值在第10天接近4.5分，已为不可接受值，表明此时的肉已经明显腐败。聚类分析见图3。

图3 聚类分析Fig.3 Cluster analysis

由图3可明显得出：根据贮藏时间的分类，将产品的前8天分成一个类别，聚类成一个类别，加上细菌总数，即可确定感官评定前8天前的TVB-N值的产品是可以接受的产品，不可接受的产品。由于假单胞菌与各种腐败指标之间的相关性非常显着，由冷冻猪肉腐败控制的 6.55 lg（CFU/g）（3.6×106CFU/g）超过此值可判定为腐败，这与刘婷婷等[24]所得假单胞菌达107CFU/g～109CFU/g牛肉货架期终点的结论是相接近的。

3 模型的建立与验证

3.1 假单胞菌生长动力学模型的建立（一、二级模型）

一级模型主要预测恒定环境条件下（如环境温度、pH值等）微生物的生长情况[19]。一般微生物生长曲线由滞后期，对数期，稳定期和衰减期四部分组成（未显示）。在微生物生长过程中，环境因素，不同生长阶段的肉类和微生物等营养物质对微生物的生长具有重要影响。近年来，常用的一级模型主要包括线型模型、Gompertz模型[20]等。微生物生长曲线的示意图见图4。

图4 微生物生长曲线的示意图Fig.4 Schematic depiction of a microbial growth curve

分别将在 0、5、10、15、20、25 ℃条件下，测量假单胞菌的数据，用Gompertz方程[21]式（1）描述不同温度条件下假单胞菌的生长动态。

式中：Nt为 t时刻微生物数量，lg（CFU/g）；N0为初始时微生物数量，lg（CFU/g）；Nmax为稳定期时微生物的最大数量，lg（CFU/g）；μm为微生物生长的最大比生长速率，h-1；t为贮藏时间，h，tb微生物生长延迟期的时间，h。

微生物生长预测二级模型方程的使用和研究都比较广泛，描述不同温度对微生物生长的影响动力学模型常用Belehradek方程来描述，其方程为

式中：μm是一级模型求出的生长速率，h-1；λ是模型待求的参数，h1/2/℃；Tmin是理论上的最小生长温度，K，是微生物生长的特征温度，K；tb是微生物生长延迟期的时间，h。

3.2 假单胞菌生长模型的可靠性评价和验证

通过建立的微生物生长预测模型可求得在5℃和15℃贮藏时假单胞菌数的预测值与实际检测的假单胞生长数进行比较，采用偏差度Bf及准确度Af两个指标来评价己经建立的特定腐败微生物生长动力学模型的可靠性[22]。

式（3）、（4）中：Nact是试验实际测得的微生物数量，lg（CFU/g）；Npre是应用微生物生长动力学模型的与同一时间的微生物数量，lg（CFU/g）；n是试验次数。

冷却猪肉货架期[23]（shelf life，SL），根据所建立的特定腐败微生物生长预测模型，可通过该特定腐败菌量从（N0）增值到（Ns）所需要的经历时间来进行预测。

根据所建立的冷却猪肉的SL方程，随机取贮藏在5℃和15℃温度条件下的冷却猪肉，测量方程中的指标算出预测值，与实际冷却猪肉的货架期进行比较，评价所建立货架期预测模型的可靠性及使用性。

3.3 假单胞菌生长的动力学模型（一级模型拟合）

在变温条件下，根据测定假单胞菌活菌数的结果，采用Matlab7.0软件进行模型拟合和回归分析。

拟合不同的一级模型，绘制了在不同温度条件下的时间-假单胞菌总数曲线，得到在不同温度条件下的生长曲线，相应的Gompertz拟合方程为：

在 0、5、10、15、20、25 ℃有氧贮藏条件下冷却猪肉中利用Gompertz方程拟合的假单胞菌生长曲线见图5。

图5 在0、5、10、15、20、25℃有氧贮藏条件下冷却猪肉中利用Gompertz方程拟合的假单胞菌生长曲线Fig.5 Growth data and fitted modified Gompertz curves of Pseudomonads spp.on chilled pork stored aerobically at 0、5、10、15、20 and 25℃

从图5中可以看出，Gompertz模型方程很好地拟合了假单胞菌在不同温度下的生长情况，生长曲线呈S型，温度对微生物生长有显着影响，随着温度达到最高菌数逐渐降低，最高0℃约250 h，最低25℃仅约50 h。

常温（变温）贮藏下初始霉菌数（N0）、最大菌数（Nmax）、最大生长速率 μm、延迟时间 tb、均方误差（meansquare error，MSE）和 R2见表4。

表4 常温（变温）贮藏下初始霉菌数（N0）、最大菌数（Nmax）、最大生长速率、延迟时间、MSE和R2Table 4 The initial number of molds N0，the maximum number of bacteria（Nmax），the maximum growth rate，the delay time，the MSE and the R2at the normal temperature（temperature）storage

由表4可以看出温度对假单胞菌生长的影响，Gompertz方程拟合的接种初始菌数在3.62 lg（CFU/g）～3.88 lg（CFU/g），最大菌数集中在 7.50 lg（CFU/g）。最大比生长速率随温度的升高而升高，延迟期的时间随温度的升高而减少。可以看出模型拟合的MSE、R2并没有成良好的规律性，R2均大于0.95且MSE较小，说明两者均拟合得很好，表明Gompertz方程能很好的应用于对假单胞菌的预测。

3.4 假单胞菌生长的动力学模型（二级模型拟合）

根据求得的假单胞菌在不同温度下的最大比生长速率，利用OriginPro9.0统计软件拟合最大比生长速率－温度（μm1/2-T），见图6，得到二级模型，μm1/2=0.134+0.010T（p＜0.01，R2=0.964），即：μm1/2=0.010[T-（-13.4）]。由二级模型 μm1/2=λ（T－Tmin），可知假单胞菌的λ=0.010℃·h1/2，假单胞菌延滞时间的拟合结果为：tb-1/2=0.0650+0.0242T。

图6 假单胞菌的生长速率与温度的拟合关系Fig.6 Growth rate and temperature of the fitting relationship about Pseudomonas sp.

表5列出了温度与比生长速率平方根模型的残差值。

表5 温度与比生长速率平方根模型的残差值Table 5 Residual value of temperature and specific growth rate square root model

可以看出，其残差的绝对值均小于0.05，说明拟合的模型关系比较合理，说明假单胞生长的平方根预测模型能较好的描述变温条件下对假单胞菌生长的影响。

3.5 模型的验证

表6显示了在5℃和15℃下的预测值和实际所得贮藏过程的真实值来计算所得的预测方程的偏差度（Bf）和准确度（Af）。

表6 冷却猪肉在5℃和15℃贮藏时微生物数量预测值的偏差度和准确度Table 6 The deviation and accuracy of the predictions of the number of microbes when the pork was stored at 5℃and 15℃

由表6可知，预测值上下波动的幅度为10%左右，预测值和实测值之间的差异即Af介于15%以内，表示误差比较低，建立的数学模型能很好的预测特定腐败微生物在5℃和15℃下的生长动态。

3.6 货架期预测模型的确立

根据建立的假单胞菌生长预测模型，可以用假单胞菌这一特定腐败菌从初始菌数（N0）增殖到最小腐败量（Ns）所需的时间来预测0～25℃有氧贮藏猪肉的剩余货架期。得知冷却猪肉的最大腐败假单胞菌数为 6.55 lgCFU/g（3.6×106CFU/g）；最大菌落总数约为7.50 lg（CFU/g）。因此，只要实时测量冷却猪肉的初始假单胞菌总数，就可以预测在0～25℃有氧贮藏猪肉的剩余货架期，表示如下：

3.7 货架期预测模型的验证

将在不同收获地点随机购买的新鲜猪肉放置在0、5℃和10℃储存温度下，另一组新鲜猪肉储存在15、20℃和25℃下。相应的肉样品最初测量并计算假气单胞菌。随着储存时间的延长，新鲜猪肉的保质期根据感官评分进行预测，货架期模型预测的货架期与实际鲜猪肉的货架期如表7所示。

表7 货架期（SL）的预测值与实际货架期的寿命比较Table 7 The predicted value of the shelf life（SL）is compared with the actual shelf life

由表7可知，在 0、5、10、15、20、25 ℃有氧贮藏条件下测定冷却猪肉的货架期，通过对猪肉剩余货架期预测值与实际货架期对比发现偏差都小于1 d，说明所建立的货架期模型可行性较好，适用价值高。

4 结论

猪肉中的假单胞菌生长和冷藏在菌落总数，TVBN值，L值和各项质量指标的感官评价方面均显着（p＜0.01），所以可以判断冷却猪肉具体腐败菌为假单胞菌。结果表明，通过聚类分析假单胞菌的冷冻猪肉腐败控制的可行性和可行性以及控制体积为6.55lg CFU/g（3.6×106CFU/g）来确定腐败程度，从而验证了假单胞菌疾病预测模型。冷冻猪肉在低温储存下的生长通过假单胞菌属的一阶和二阶模型拟合来评估。在储存条件 0、5、10、15、20、25 ℃下通过 Gompertz方程测定冷冻猪肉的保质期。预测结果偏离实际储存结果不到一天，表明所建议的保质期模型更加可行，为在变温条件下实时获得冷冻猪肉的剩余保质期奠定了基础。建立的假单胞菌生长动力学模型能快速可靠地预测恶臭假单胞菌的动态生长，为假单胞菌的预测和监测提供了有效工具，有效延长冷却猪肉货架期，保持肉制品风味，保障人类食用健康。

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