★ 刘新辉 李顺民（深圳市中医院肾病科 广东 深圳 518033）

马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy，AAN）是摄入含有马兜铃酸类成分中草药而导致的肾小管间质疾病［1］。最近中国国家慢性肾脏病调查工作组横断面问卷调查结果显示：1.5%的中国成人长期服用含马兜铃酸类中草药。长期服用含马兜铃酸中草药与慢性肾脏病发生独立相关［2］。新近研究证实马兜铃酸亦是影响多瑙河流域巴尔干肾病的致病因素［3］。由于受影响的地域及人群广泛，AAN已成为全球性的公共卫生问题［4］。然而，目前仍缺乏有效治疗AAN的药物。

近端肾小管上皮细胞是马兜铃酸肾损伤的首要靶点，其功能的维持极度依赖于线粒体［5］。新近的研究发现β2肾上腺素受体激动剂福莫特罗可以通过过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子 -1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）信号通路增加线粒体生物合成，从而有助于缺血再灌注引起的急性肾损伤的恢复［6］。然而，福莫特罗能否基于其对PGC-1α信号通路的调节作用而对AAN发挥治疗作用，目前尚无相关报道。本研究拟通过小鼠急性AAN模型探讨福莫特罗对急性AAN的保护作用及可能机制。

1 材料

1.1 动物 24只8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重18～22g，购自广东省医学实验动物中心（生产许可证：SCXK（粤）2013-0002）。每日12h照明，饲养温度20℃～25℃，湿度50%～70%。自由摄水、饮食。

1.2 试剂 马兜铃酸I（AAI）及福莫特罗（formoterol）均购自Sigma-Aldrich公司；组织DNA提取试剂盒QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN公司）；引物序列（life technologies公司）；SYBR Green（Roche公司）。细胞色素C氧化酶亚基I（COX-I）（abcam公司）；PGC-1α（Santa Cruze公司）；β-actin（Sigma公司）；二抗（CST公司）。

1.3 仪器 全自动生化分析仪（Roche）；石蜡包埋机、切片机（Leica）；普通光学显微镜（Nikon）；荧光定量PCR仪（Life Tech）；全自动凝胶成像和化学发光图像分析系统：ChemiDocTM MP Imaging System（Bio-Rad Laboratories）；垂直电泳仪、转膜仪（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药方法 24只小鼠根据体重随机分为4组：正常对照组、正常+福莫特罗组、模型组、模型+福莫特罗组，每组6只。造模方法为腹腔注射 AAI 5mg/kg/d，持续 5d［7］。急性AAN的造模依据为突发的肾功能急剧下降。在本研究中我们采用血肌酐及尿素氮水平的显著升高作为造模成功的指标。根据前期研究基础，我们采用该方法制备急性AAN模型的成功率在90%以上。福莫特罗给药方法为造模前2天开始给药，剂量为0.3mg/kg/d，共给药7d。杀检后留取血清及肾脏标本。

2.2 尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）测定 采用全自动生化分析仪测定。

2.3 肾脏病理检测 石蜡切片行PAS染色。肾脏病理损伤根据肾小管上皮细胞坏死、刷状缘脱落、管型及小管扩张的综合比例进行评分。0分=无以上改变；1分=以上改变＜10%；2分=以上改变11%-25%；3分=以上改变26%-45%；4分=以上改变46%-75%；5分=以上改变＞76%［8］。

2.4 PCR 按照QIAamp DNA Mini Kit试剂盒说明书要求提取肾脏皮质总DNA。取2μL DNA样品于NanoDrop 1000紫外分光光度计检测260nm处吸光值，依据所测DNA浓度，设定一定体积V，换算后用DEPC水配成同一浓度备用。引物序 列 如 下：mtDNA forward 5＇-TTTTATCTGCATCT GAGTTTAATCCTGT-3＇ and reverse 5＇-CCACTTC ATCTTACCATTTATTATCGC-3＇；18S rRNA forward 5＇-GGACCTGGAACTGGCAACAT-3＇ and reverse 5＇-GCCCTGAACTCTTTTGTGAAG-3＇。反应条件为：95℃ 10min→95℃ 15sec→60℃ 1min 循环40次。采用内参DNA片段表达ΔCt法计算目的DNA片段的表达，反映mtDNA拷贝数的相对定量。

2.5 蛋白印记 提取各组小鼠肾脏皮质蛋白并测浓度，将等量的蛋白加入上样孔中依次进行电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭60min；孵育一抗、二抗，曝光显影，图像分析。

2.6 统计学方法 结果以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），并进行两两比较。所有检验应用SPSS16.0统计软件进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠BUN、Scr水平比较 模型组小鼠BUN及Scr显著升高（P＜0.01）。经福莫特罗治疗后AAN小鼠BUN及Scr均有一定程度的下降（P＜0.05，P＜0.01）。结果见图1。以上结果提示急性AAN造模成功；福莫特罗可显著改善AAN小鼠肾功能。

图1 各组小鼠BUN（A）及Scr（B）水平

3.2 肾脏病理改变 由图2（A）可见，模型组小鼠肾脏病理表现为肾小管上皮细胞坏死、脱落，刷状缘丢失，管型及肾小管扩张。福莫特罗治疗组以上损伤均有所恢复。肾脏病理评分与PAS染色相符（图2B）。以上结果提示福莫特罗可显著改善AAN小鼠肾脏病理损伤。

图2 各组小鼠肾脏病理改变（A）及评分（B）

3.3 线粒体生物合成 由图3（A）所示，模型组小鼠肾脏线粒体DNA拷贝数显著下降（P＜0.01），而福莫特罗治疗组则有所恢复（P＜0.05）。进一步的分析发现，模型组小鼠肾脏PGC-1α及COX-I表达显著下调，而经福莫特罗治疗后可显著恢复其表达（P＜0.01）（图3B-D）。以上结果提示AAN小鼠肾脏线粒体数量下降，可能与PGC-1α信号通路有关。

图3 各组小鼠线粒体生物合成改变

4 讨论

本研究采用AAI诱导C57BL/6小鼠发生急性AAN，并探讨福莫特罗的干预作用及可能机制。结果表明，AAI 5 mg/kg/d持续腹腔注射5天可以引起急性AAN，表现为BUN及Scr的显著升高及肾脏病理损伤。AAN小鼠肾脏线粒体数量下降，线粒体合成的关键蛋白表达下调。福莫特罗治疗可显著改善AAN小鼠的肾功能及病理损伤，并可上调线粒体生物合成。

福莫特罗是一种长效的特异性β2肾上腺素受体激动剂。最近的研究发现，福莫特罗可以增加小鼠骨骼肌细胞中PGC-1α mRNA的表达。而且，锻炼诱导的PGC-1α mRNA增加可以被预处理β2肾上腺素受体拮抗剂所抑制，提示β2肾上腺素受体激活介导了锻炼诱导的骨骼肌PGC-1α表达的增加［9］。由于PGC-1α是线粒体生物合成的关键蛋白，因此福莫特罗可以增加线粒体生物合成［10-11］。本研究中AAN小鼠肾脏线粒体PGC-1α及线粒体生物合成均显著下调，而福莫特罗治疗后可上调PGC-1α、增加线粒体呼吸复合体亚基的表达及线粒体DNA拷贝数。该实验结果与Jesinkey等的研究相一致，其研究表明福莫特罗可以通过PGC-1α-线粒体生物合成改善缺血再灌注引起的小鼠急性肾损伤［6］。

综上所述，本研究结果提示福莫特罗可以有效改善AAI诱导的急性AAN，其机制可能与促进线粒体生物合成有关。该研究提示针对PGC-1α信号通路调节线粒体生物合成可作为AAN的治疗靶点。

［1］刘新辉,阳晓.马兜铃酸肾病:一个仍需重视的问题[J].中国中西医结合杂志, 2013, 33(4):585-589.

［2］Zhang J, Zhang L, Wang W, et al. Association between aristolochic acid and CKD: a cross-sectional survey in China [J]. Am J Kidney Dis, 2013,61(6):918-922.

［3］Gökmen MR, Lord GM. Aristolochic acid nephropathy [J]. BMJ, 2012,344:e4000.

［4］Grollman AP. Aristolochic acid nephropathy: Harbinger of a global iatrogenic disease [J]. Environ Mol Mutagen, 2013, 54(1):1-7.

［5］Pozdzik AA, Salmon IJ, Debelle FD, et al. Aristolochic acid inducesproximal tubule apoptosis and epithelial to mesenchymal transformation [J]. Kidney Int, 2008, 73(5):595-607.

［6］Jesinkey SR, Funk JA, Stallons LJ, et al. Formoterol restores mitochondrial and renal function after ischemia-reperfusion injury [J]. J Am Soc Nephrol, 2014, 25(6):1 157-1 162.

［7］Wu J, Liu X, Fan J, et al. Bardoxolone methyl (BARD) ameliorates aristolochic acid (AA)-induced acute kidney injury through Nrf2 pathway [J]. Toxicology, 2014, 318(1):22-31.

［8］He Z, Lu L, Altmann C, et al. Interleukin-18 binding protein transgenic mice are protected against ischemic acute kidney injury [J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2008, 295(5):F1 414–F1 421.

［9］Sutherland LN, Bomhof MR, Capozzi LC, et al. Exercise and adrenaline increase PGC-1{alpha} mRNA expression in rat adipose tissue [J]. J Physiol, 2009, 587(7):1 607-1 617.

［10］Wills LP, Trager RE, Beeson GC, et al. The β2-adrenoceptor agonist formoterol stimulates mitochondrial biogenesis [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2012, 342(1):106-118.

［11］Peterson YK, Cameron RB, Wills LP, et al. β2-Adrenoceptor agonists in the regulation of mitochondrial biogenesis [J]. Bioorg Med Chem Lett,2013, 23(19):5 376-5 381.