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(浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 310018)

猪病毒性腹泻是一类呈全国性散发流行的急性、接触性肠道传染病。临床上以引起仔猪水样腹泻、呕吐、脱水消瘦甚至死亡为典型症状，成年猪多不可见临床症状或仅有一过性软便。该病病原主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)，是影响我国生猪养殖业经济效益和健康可持续发展的重要因素之一。

2010年入冬以来，全国大部分地区猪场爆发了严重的仔猪病毒性腹泻疫情，高发病率、高死亡率的流行态势给养殖业造成了巨大的经济损失[1]。随后，徐丽华[2]等针对2008-2011年浙江省1118份临床病猪病料展开病毒性腹泻病原学调查，PEDV和TGEV感染率分别为84.4%和9.0%。张传亮[3]等对2011-2012年浙江省采集的136份临床腹泻猪病料检测结果显示，PEDV检出率最高，为59.56%；TGEV和PoRV的阳性率分别为2.94%和4.60%。为了解近几年浙江省猪病毒性腹泻流行变化情况，本研究于2016年4月至2017年3月在浙江省8个市的规模化养殖场随机采集临床健康猪粪便样品611份、并对送检发病猪小肠样品50份进行PEDV、TGEV、PoRV病原学检测，旨在了解当下浙江省养殖场中三种腹泻病毒感染情况，从而为该病的防控指导工作提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂及仪器 MagMAXTM-96 viral RNA Isolation Kit(applied biosystems)购自杭州怡丹生物技术有限公司；无水乙醇、异丙醇购自生工生物工程有限公司；PEDV、TGEV、PoRV三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；RNase-free H2O购自宝生物工程(大连)有限公司。Kingfisher flex-96全自动核酸提取仪、小型高速离心机为Thermo Fisher Scientific公司产品，罗氏LightCycler®480实时荧光定量PCR仪为Roche公司产品。

1.1.2样品来源 2016年4月至2017年3月，在浙江省8个市的32个规模化养殖场采集临床健康猪粪便样品611份。50份临床发病猪小肠样品为2016年二季度来自浙江省6个市的16个规模猪场送检样品。

1.2方法

1.2.1样品处理 取适量粪便样品于2 mL离心管中，加入900 μL无菌PBS，涡旋震荡3 min，10000 r/min离心5 min后取上清液于-80℃备用。病猪小肠样品取适量置于MP组织研磨管中，加入900 μL无菌PBS，每次3 min，反复研磨3次后于-40℃冻融3次，10000 r/min离心5 min后取上清液于-80℃备用。

1.2.2核酸提取及荧光RT-PCR检测 按照MagMAXTM-96 viral RNA试剂盒操作说明提取样品病毒核酸。采用PEDV、TGEV、PoRV三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行三种腹泻病毒的病原检测，结果依据试剂盒判定标准确定。

2 结果与分析

2.1PEDV、TGEV、PoRV流行情况分析 采用实时荧光RT-PCR方法对611份猪粪便样品、50份猪小肠样品进行PEDV、TGEV、PoRV检测。结果显示(见表1)，健康猪粪便样品中PEDV阳性率为4.09%，PoRV阳性率为6.55%。50份发病猪小肠样品的PEDV和PoRV检出率分别为74.00%、6.00%，未检出TGEV阳性样品，亦未发现PEDV、TGEV、PoRV三种病原间的混合感染情况。较之近年来山东省[4]、黑龙江省[5]、广西壮族自治区[6]关于猪腹泻病的流行病学调查结果，同样以PEDV为腹泻主要病原，其次为PoRV，表明浙江省猪病毒性腹泻病流行趋势与我国其他省份大体相符。

通过检验健康猪粪便和发病猪小肠样品中PoRV及PEDV阳性率的差异性，结果PoRV阳性率差异不显著(P>0.05)，PEDV阳性率差异显著(P<0.05)，表明PoRV感染不是目前猪腹泻临床发病的主要因素。由此可见，在浙江省PEDV仍为病毒性腹泻的主要致病原，且在规模化养殖场中存在隐性带毒现象，一旦气候环境等条件发生变化，易发生疫情；通过日常流行病学监测掌握各地区或猪场的隐性感染率基线，对于预警PEDV、PoRV流行发病的风险十分重要。

表1 不同类型样品中腹泻病原检测结果

2.2健康猪场PEDV、PoRV和TGEV感染情况分析 PEDV、PoRV和TGEV在我省8个市中有7个市健康猪场中检测到目标病原污染的存在。场点分布情况显示，针对此3种病原，32个规模化养殖场的阳性率为53.13%，其中PEDV和PoRV的阳性率分别为28.13%和43.75%，同时存在PEDV与PoRV感染的场点占比达18.75%。各场点样品阳性率波动较大，PoRV场点样品阳性率最高为100%，PEDV则为20.00%，表明自2016年二季度以来，浙江省健康猪场中PEDV和PoRV的污染范围较广。

按时间分布进行分析，自2016年第二季度至2017年第一季度(见图1)，浙江省健康猪场在不同季节均有PEDV与PoRV感染。检测结果表明，2017年第一季度PEDV阳性场比例上升趋势明显，与该阶段猪场腹泻发病高峰时间段一致，其他季节PEDV样品阳性率均低于第一季度，但持续可检测到病原，可能与近年来PED发病范围有所扩大、全年呈散发性流行有关。本次PoRV在全省的检出率较2012年显著上升[3]，尽管第一季度是腹泻病高发季节，但PoRV检测率为零，表明其非一季度引起猪腹泻病高发的主要原因；其他季度的高检出率提示着PoRV引起腹泻病从而造成猪场损失的风险正在增加，需加强对该病原的监控。

图1 健康场不同时段PEDV、PoRV感染阳性率

2.3发病场3种病原感染情况的分析 50份发病猪小肠样品检测结果显示，16个规模猪场中有12个规模猪场送检的样品均为PEDV阳性，1个场点样品为PoRV阳性，可见PEDV仍为导致临床腹泻发病的主要疫原。本调查中，3个场点的猪小肠样品，尽管临床腹泻症状明显，但未检出目的病原，说明除传统病毒性病原PEDV、TGEV、PoRV外，还需对引起猪发生腹泻的原因进行深入分析。

对比相同时间段健康猪和发病猪样品检测结果(如图2)，发病猪PEDV检出率为74.00%，而健康猪未发现PEDV感染，表明在特定季节交替、早晚温差变化的条件下，隐性感染猪受环境应激的影响，PEDV引起发病的数量明显上升。差异性分析显示同期PoRV在发病猪和健康猪中的感染率无显著差异，亦表明PoRV不是引起猪病毒性腹泻病的主要病原。

图2 相同时间段健康猪和发病猪检测结果的比较

3 讨论

近年来猪病毒性腹泻广泛存在于我国养殖场中，是引起仔猪高死亡率、严重危害养猪业经济效益的主要疫病之一。由于该病在不同地区的感染率差别较大，及时掌握不同区域病原的流行情况，将为该病的防控工作提供有效地指导。陈平洁[7]等对广东省猪规模化养殖场猪病毒性腹泻的调查研究显示，PEDV检出率最高(31.47%)，PoRV和TGEV的检出率分别为27.92%和0%。李天芝[8]等针对2015年鲁北地区猪病毒病检测结果显示，PEDV、PoRV和TGEV阳性检出率分别为16.00%、4.20%和2.80%，其中三种病原在散养(场)户的检出率均略高于规模场。大北农集团北京动物医学研究中心[9]对2011年至2015年9月全国送检腹泻仔猪病例的病原学调查结果显示，2010年以来我国PEDV和TGEV的感染十分普遍，以PEDV为主导。本研究结果证实，近年来浙江省传统病毒性腹泻病原的流行风险较低，且呈现较为平稳的流行态势。近两年来，PEDV仍是引起浙江省猪病毒性腹泻的主要疫病病原，与其他区域稍有差异的是未检测到TGEV感染。尽管在猪腹泻病高发时段PoRV的检出率为零，但临床健康场PoRV的高检出率，提示目前在本地区的病毒性腹泻病防控中除PEDV这一重点病原外，PoRV引起腹泻的潜在风险需加以重视。

近年的调查研究认为，腹泻类病例趋于复杂化，PEDV与TGEV、PDCOV(δ冠状病毒)等混合感染比例升高，且流行毒株多为变异株[9]。猪病毒性腹泻是一类与猪场饲养管理水平和卫生状况紧密相关的疫病，随着浙江省养猪业的规模化、集约化发展，为有效防治腹泻类疫病，一方面要做好猪舍保温、消毒等卫生管理工作，尤其是季节交替时段，以有效控制PoRV的流行；另一方面应结合实验室检测结果，了解流行毒株，针对性地选用PEDV、TGEV和PoRV二联或三联疫苗，并制定合理的免疫程序进行预防十分必要。

[1] 李瑞香,王翠萍.猪病毒性腹泻病的流行特点及防控措施[J].畜牧与饲料科学,2016,37(2):111-112.

[2] 徐丽华,王一成,袁秀芳,等. 2008-2011年浙江省猪主要病毒性疫病病原流行病学调查[J].浙江农业学报,2012,24(3):383-387.

[3] 张传亮,陈星宇,赵灵燕,等.浙江省猪病毒性腹泻流行病学调查及防控对策[J].中国动物检疫,2013,30(7):47-48.

[4] 薛瑞雪,田野,田夫林,等.山东省部分地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J].中国预防兽医学报,2015,37(4):254-257.

[5] 窦海燕,秦立鑫,张智明,等.黑龙江省部分地区PEDV和TGEV流行病学调查[J].兽医导刊,2016,12:75-76.

[6] 郭旋,陈静,刘欢,等．广西仔猪腹泻病毒病原流行病学调查[J]．南方农业学报，2013，44(1)：155-160．

[7] 陈平洁,孙彦伟,韩雪,等.广东省仔猪病毒性腹泻横断面研究[J].中国动物检疫,2016,33(10):1-6.

[8] 李天芝,于新友,王金良,等.2015年鲁北地区猪病毒病检测结果与分析[J].养猪SWINE PRODUCTION,2016,33:121-122.

[9] 近年来我国猪腹泻病的病原情况及防控方法分析[J].中国动物保健，2016,1(18):39-40.

[10] 杨波.猪病毒性腹泻病的特点与紧急防控措施[J].养殖技术顾问,2012,7:150.