刘 熙，于冬梅，陈进汝，高 波，李冬梅，李春艳

（大理大学药学与化学学院，云南大理 671000）

肺癌为肺部原发性恶性肿瘤，绝大多数起源于支气管粘膜上皮，2014年美国癌症协会最新报告显示〔1〕，肺癌占男性新增病例的第二位，仅次于前列腺癌；占女性新增病例的第二位，仅次于乳腺癌。尽管多种化疗药物的发现和放疗技术的改进，以及近年来生物药物的发现，使肺癌的治疗取得了一定的进展，但是相较于其他肿瘤而言，其发病率和死亡率仍居高不下〔2-3〕。因此，寻找一种新的高效低毒的抗肿瘤药物，增强肺癌的治疗疗效，改善患者的生活质量尤为迫切。

云南松松塔是松科松属植物云南松（Pinus yun⁃nanensis Franch.）的球果，药用历史悠久，《本草纲目》中记载其具有抗病毒、祛痰、止咳平喘、祛风润肠、安神和镇静等功效〔4〕。现代药理研究发现，云南松松塔具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等作用〔5〕。近年来有文献报道，松科属植物具有一定的抗癌活性〔6-9〕，但未见云南松松塔提取物对肺癌的影响。故本研究选择肺癌细胞株（NCI-H661、NCI-H157、NCI-H292、SK-MES-1、A549）进行体外抗肿瘤活性物质筛选，考察云南松松塔提取物对肺癌细胞增殖作用的影响。在此基础上，探讨云南松松塔提取物对人正常肺细胞（MRC-5）的毒性作用，筛选出对肺癌细胞抑制作用好且对人正常肺细胞毒性小的活性成分，为云南松松塔抗肿瘤机制的进一步研究及云南松松塔的药用开发提供理论依据。

1 试验材料

1.1 云南松松塔样品 云南松松塔采自大理州漾濞县，经大理大学生药教研室夏从龙教授鉴定为松科松属植物云南松（Pinus yunnanensis Franch.）的松塔。样品标本保存于大理大学天然药物化学教研室。ST-D：醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液，一倍醇溶后得到ST-D（得率0.03%）；ST-E：滤液两倍醇沉后过滤得沉淀ST-E（得率0.09%）；ST-F：滤液两倍醇溶得到的滤液再五倍醇溶得到的沉淀ST-F（得率0.10%）；ST-DEF：醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液，一次五倍醇溶，过滤，得沉淀ST-DEF（得率0.78%）。在本实验中，样品ST-D、ST-E、ST-F、STDEF均用DMEM培养基溶解。

1.2 细胞株 NCI-H661：人大细胞肺癌细胞；NCIH157：人非小细胞肺腺癌细胞；NCI-H292：人肺癌细胞；SK-MES-1：人肺鳞癌细胞；A549：人肺腺癌细胞；MRC-5人正常肺细胞，均购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。

1.3 试剂与仪器 DMEM培养基及胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶（Thermo公司）；噻唑蓝（MTT）、Hepes、双抗（青霉素100 mg∕L，链霉素100 mg∕L）、二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma公司；顺铂（DDP，粉针剂，山东罗欣药业股份有限公司）；Yj-1450无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司）；IX-7倒置相差显微镜（Olympus）；水套式CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；Es-315高压灭菌器（日本Tomykogyo公司）；连续波长酶标仪（Bio-Tek公司）。

2 方法

2.1 样品配制 将ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF粉末及DDP用含10%灭活FBS的DMEM培养基溶解，0.22 μm的滤膜过滤，配制成终浓度为1 mg∕mL的溶液，试验时稀释成浓度梯度溶液。

2.2 云南松松塔提取物对人肺癌细胞增殖的影响肺癌细胞（NCI-H292、NCI-H661、SK-MES-1、A549、NCI-H157）分别用含10%灭活FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后，离心，弃去上清液，用完全培养基调细胞密度至1×105个∕mL，接种于96孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h后，弃去上清液后，分别于每个实验孔中加入浓度梯度（终浓度分别为1 000.00、250.00、62.50、15.63、3.91、0.98 μg∕mL）云南松松塔提取物样品溶液（STD、ST-E、ST-F、ST-DEF），每个浓度设3个复孔，同时设置阳性对照组（DDP）、阴性对照组和空白对照组。放入37℃、5%CO2培养箱中培养72 h后，弃去上清液，加入MTT溶液（5 mg∕mL）20 μL∕孔，继续培养4 h后，分别加入DMSO溶液150 μL∕孔，待紫色结晶溶解后，在波长570 nm检测各孔OD值，按下式计算抑制率。

抑制率（%）=［1-（OD实验-OD空白）（∕OD阴性-OD空白）］×100%

2.3 云南松松塔提取物对MRC-5细胞的作用取对数生长期MRC-5细胞，用0.25%胰酶消化后，离心，弃去上清液，完全培养基调细胞密度至1×105个∕mL，接种于96孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h后弃去上清液后，加入云南松松塔提取物浓度同“2.2”，同时设置阴性对照组和空白对照组。在37℃、5%CO2培养箱中培养72 h后，弃去上清液，每孔加入5 mg∕mL MTT 20 μL，继续培养4 h后，再分别加入DMSO溶液150 μL，待紫色结晶溶解后，在波长570 nm检测各孔OD值，按下式计算出存活率。

存活率（%）=（OD实验-OD空白）（∕OD阴性-OD空白）×100%

2.4 统计学处理 实验数据均采用SPSS 17.0统计软件进行处理，数据以（xˉ±s）表示，多组间均数比较采用方差齐性检验后用单因素方差分析（one-way ANVOA）进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 云南松松塔提取物作用72 h时对人肺癌细胞增殖的影响 云南松松塔提取物72 h对人肺癌细胞增殖的影响见表1、图1。与阴性对照组比较，云南松松塔4个提取物在1 000.00 μg∕mL时均对NCIH292、NCI-H661、A549、SK-MES-1、NCI-H157 细胞增殖有抑制作用，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。云南松松塔4个提取物中，ST-D和ST-E在相同质量浓度梯度下，ST-E对NCI-H292、NCIH661、A549、NCI-H157细胞的抑制作用强于STD，而随着云南松松塔提取物醇溶倍数的增加，STF对以上肺癌细胞株的抑制作用在相同质量浓度梯度下弱于ST-D、ST-E；采用醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液经一次五倍醇溶过滤后得到的ST-DEF对NCI-H661细胞的抑制作用与ST-F对NCI-H661的抑制作用相差不大，而ST-DEF对肺癌细胞株（NCI-H292、A549、SK-MES-1、NCIH157）的抑制作用强于ST-F；ST-DEF和ST-D对NCI-H661、A549、SK-MES-1的抑制作用相差不大，但ST-DEF对肺癌细胞株NCI-H292、NCI-H157细胞的抑制作用强于ST-D；ST-DEF和ST-E对肺

癌细胞株NCI-H292、SK-MES-1、NCI-H157细胞相差不大，但ST-E对NCI-H661、A549细胞的抑制作用强于ST-DEF。提示提取工艺的不同对肺癌细胞株增殖的抑制作用有所不同。云南松松塔各提取物在不同质量浓度梯度下与阳性对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与阴性对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明云南松松塔提取物有体外抗肺癌作用但作用弱于DDP（阳性对照组）。

3.2 云南松松塔提取物72 h时对MRC-5细胞的作用

表1 72 h时云南松松塔提取物对人肺癌细胞增殖作用的影响（xˉ±s，n=3）

图1 云南松松塔提取物对肺癌细胞的抑制作用

在观察云南松松塔提取物72 h时对人肺癌细胞增殖影响的基础上，同时考察云南松松塔提取物对人正常肺细胞（MRC-5细胞）的影响，以期筛选出活性高、毒性小的抗肿瘤活性提取物。从表2中结果可知：云南松松塔提取物在不同质量浓度与MRC-5细胞共同孵育72 h后，在1 000.00 μg∕mL时，ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF对MRC-5细胞的存活率分别为（70.68± 0.01）%、（73.82±0.00）%、（71.91±0.01）%、（73.11±0.04）%。提示在云南松松塔提取物ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF对人正常肺细胞的毒性小（见表2）。云南松松塔各提取物在不同质量浓度下与DDP比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01），说明DDP对MRC-5细胞毒性大于云南松松塔各提取物。见图2。

4 讨论

肺癌主要分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC约占所有肺癌的85%，主要包括鳞状细胞癌（鳞癌）、腺癌和大细胞癌。目前NSCLC治疗的主要方法包括手术、放疗、化疗及生物治疗等，但由于大部分的患者发现时已处于中晚期，患者5年生存率很低。因此，探索肺癌的发病原因及寻找有效的治疗靴点，对于肺癌的治疗起到积极的推动作用。

图2 云南松松塔提取物对正常人肺细胞的存活率

表2 72 h时云南松松塔提取物对人正常肺细胞的毒性作用（xˉ±s，n=3）

我国中药资源丰富，中医药在治疗肿瘤方面积累了丰富的经验，疗效显著，无明显不良反应，且具有多靶点、多部位、多途径、多效应、价格低廉、效果明显、易于普及等优点〔10〕。从我国国情出发，利用中医药的独特性及经济性，开发传统的具有我国特色的抗肺癌药物或抗肺癌辅助药物是完全可能和可行的。松科松属植物多为常绿乔木，稀为灌木，北极地区、北非、中美、中南半岛、苏门答腊赤道以南地方均有分布；松属我国产22种10变种，引入16种2变种，遍布全国各地〔11〕。云南松主要分布于云南，资源十分丰富。近年来，国内外已有多位学者对不同松科植物进行了研究，如发现日本五针松松塔中的木质素与糖的结合体具有抗肿瘤活性〔12〕，红松松塔、红松球果鳞片具有一定的抗癌活性〔13〕。这些研究提示云南松松塔中可能有抗癌作用的成分。故本文从细胞水平探讨云南松松塔提取物（ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF）对人肺癌细胞（包括小细胞肺癌细胞株和非小细胞肺癌细胞株）增殖的影响和人正常肺细胞的作用，结果表明：云南松松塔4个提取物中，ST-D和ST-E在相同质量浓度梯度下，ST-E对NCI-H292、NCI-H661、A549、NCI-H157的抑制作用强于ST-D，提示随着醇溶倍数的增加，活性成分并未损失，且对NCI-H292、NCI-H661、A549、NCI-H157肺癌细胞株的抑制作用增强，而随着云南松松塔提取物醇溶倍数增加至五倍醇溶得到的ST-F对肺癌细胞株NCI-H292、NCI-H661、A549、SK-MES-1、NCI-H157的抑制作用在相同质量浓度梯度下均弱于ST-D、ST-E，提示其抗肺癌活性部位主要集中在ST-E中；另外改变提取工艺，采用醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液经一次五倍醇溶过滤后得到的STDEF对NCI-H661的抑制作用与ST-F相差不大，但相同质量浓度梯度下ST-DEF对NCI-H292、A549、SK-MES-1、NCI-H157的抑制作用强于ST-F；此外 ST-DEF和 ST-D 对 NCI-H661、A549、SKMES-1的抑制作用相差不大，但ST-DEF对肺癌细胞株NCI-H292、NCI-H157的抑制作用强于ST-D；ST-DEF和ST-E对肺癌细胞株NCI-H292、SKMES-1、NCI-H157相差不大，但ST-E对NCI-H661、A549的抑制作用强于ST-DEF。提示改进工艺后得到的ST-DEF都含有抑制肺癌细胞NCI-H292、NCI-H661、A549、SK-MES-1、NCI-H157的活性成分，ST-DEF某些成分对抑制肺癌细胞NCI-H292、NCI-H157增殖的作用强于ST-D，而某些成分抑制肺癌细胞NCI-H661、A549增殖的作用弱于ST-E。由此确定云南松松塔抗肺癌活性部位为ST-DEF。在本试验中，云南松松塔各提取物在不同质量浓度梯度下与阳性对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与阴性对照组比较，差异同样具有统计学意义（P＜0.05），说明云南松松塔提取物有体外抗肺癌作用但作用弱于DDP（阳性对照组）。云南松松塔各提取物中抗肺癌活性组段是否存在活性更强的单体，有待进一步对其活性组段进行提取、分离、纯化、结构鉴定及体内外相关的药效研究。除此外，考察云南松松塔提取物对人正常肺细胞（STDEF）的毒性作用，筛选得到抗癌活性高、对肺细胞毒性小的提取物，进而有利于后续研究及临床应用，由实验结果可知在高浓度（1 000.00 μg∕mL）下，ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF对MRC-5细胞的存活率分别为（70.68±0.01）%、（73.82± 0.00）%、（71.91±0.01）%、（73.11±0.04）%。其余浓度下对MRC-5细胞均无毒性作用。云南松松塔各提取物在不同质量浓度下与DDP比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01），说明DDP对MRC-5细胞毒性大于云南松松塔各提取物，DDP对MRC-5细胞毒性作用大也再次说明DDP抗肿瘤作用与细胞毒性有关。

综上所述，云南松松塔4个提取物中，ST-E和ST-DEF为抗肺癌活性较好组段，且在高浓度下对人正常肺细胞毒性小。目前，本课题组正在对云南松松塔提取物的活性部位进行进一步的分离纯化，以期从中筛选出具有抗肺癌活性的化合物，并阐明其作用机制。

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