王金桥，李 靖

0 引言

五味子属植物中的一个活性单体成分五味子乙素(Schisandrin B),具有较强的生物活性[1]。目前对其药理作用进行了大量的研究，证实五味子乙素可以抑制肝细胞转氨酶活性、抗炎、降低脂质过氧化，表现出抗氧化应激、护肝等生物活性[2-5]。近期研究表明，五味子乙素还表现出一定的抑制肿瘤功效，可以阻滞上皮间质转化达到降低乳腺癌细胞侵袭和迁移的目的，阻断胆囊癌细胞的分裂周期来抑制该细胞的增殖，诱导其凋亡，抑制cyclin D1 mRNA的水平，诱导胃癌细胞的凋亡[6-10]。大肠癌是癌症死亡的主要原因之一，其术后生存率较低[11]，找到新的治疗方法一直是大肠癌治疗的研究热点。早期研究发现，五味子乙素能够逆转人结肠癌细胞多药耐药性[12]，抑制结肠癌SW480细胞增殖、诱导其凋亡[13]，但其对大肠癌细胞的作用机制报道甚少。因此，本文探讨了五味子乙素对大肠癌SW116细胞凋亡的作用及PI3K/Akt信号通路的影响，阐明其抑制肿瘤作用的关键靶点，为进一步研究五味子乙素抗肿瘤作用提供实验和理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料和仪器 大肠癌SW116细胞株来源于美国ATCC细胞库；五味子乙素(杭州临安天鸿生物科技有限公司，批号：5521-65-6，纯度≥98%)；CCK8试剂盒(美国Sigma公司，批号：WH1199)；Annexin-FITC凋亡试剂盒(广州碧云天生物试剂公司，批号：P0012S-07)；Bax、Bcl-2、PI3K、p-Akt、Akt及β-actin抗体购自美国Sigma公司；Victor3 1420 Multilable Counter酶标仪(DX540，美国)；SDS-PAGE凝胶电泳(北京六一仪器厂，型号：DYCZ-24DN)；双色红外激光成像系统(BIO-RAD，美国)。

1.2 细胞培养及分组 人大肠癌细胞SW116培养于10%小牛血清、1 000 U/mL青霉素、80 mg/mL链霉素、pH 7.2的PRMI1640培养基中，培养条件为5% CO2、37 ℃，SW116细胞为上皮型贴壁生长，每隔2～3 d进行传代培养，接种后24 h取对数生长期的细胞用于后续实验。SW116细胞分为空白对照组(A组)、10 μg/mL五味子乙素组(B组)、20 μg/mL五味子乙素组(C组)及40 μg/mL五味子乙素组(D组)。其中A组细胞加入相同体积的培养基，细胞接种24 h后加入不同浓度的五味子乙素，继续处理细胞24～72 h，消化收集细胞，检测各项指标。

1.3 CCK8实验 将生长良好的SW116细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化、收集、制备成细胞悬液，尽量吹打均匀，接种于96孔板，平行设置5个复孔。当药物干预细胞24 h后，吸去旧培养基，每孔加入10 μL CCK8试剂，于5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养1 h，用酶联免疫分析仪于450 nm处测定各孔的吸光度值。

1.4 细胞凋亡率检测 将生长良好的SW116细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化、收集，制备成细胞悬液，尽量吹打均匀，接种于6孔板。收集经不同浓度五味子乙素处理后的SW116细胞，用无菌的PBS清洗细胞2次，2 000 r/min离心5 min后收集细胞，加入1 μL Annexin-FITC,混匀后加入5 μL Propidium Iodide混匀；避光反应5 min，上流式细胞仪进行细胞凋亡率检测。

1.5 细胞蛋白浓度检测 将生长良好的SW116细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化、收集，制备成细胞悬液，尽量吹打均匀，接种于6孔板。细胞经不同浓度药物处理24 h后，消化收集细胞，提取蛋白并检测蛋白浓度。每孔上样30 μg，进行SDS-PAGE垂直电泳，然后电转至NC膜，脱脂奶粉封闭1 h；进行一抗孵育，用TBST洗膜，每10 min清洗1次，共3次，将NC膜放入稀释好的Bax、Bcl-2、PI3K、p-Akt及Akt抗体(1∶1 000稀释)中，4 ℃摇动过夜；TBST洗膜后将NC膜放入辣根过氧化物酶标记的二抗中(1∶3 000)，室温孵育1.5 h；TBST细胞后进行蛋白表达量分析。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制实验 CCK8法结果表明，与A组相比，不同剂量五味子乙素干预的SW116细胞生长明显受到抑制。加入五味子乙素24 h后，不同剂量药物干预的细胞增殖抑制率显著升高，与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)；加入五味子乙素处理细胞48、72 h后，不同浓度药物干预后的细胞增殖受到明显抑制，表现出时间依赖性。五味子乙素浓度越高，细胞增殖抑制率越显著，并且各浓度组之间的抑制作用差异均有统计学意义(P<0.05)，表现出剂量依赖性。见表1。

表1 五味子乙素对SW116细胞增殖抑制率的影响(%)

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，&P<0.05；与24 h时比较，△P<0.05；与48 h时比较，▲P<0.05

2.2 细胞凋亡检测实验 五味子乙素未干预时，4.7%的SW116细胞发生凋亡。加入五味子乙素处理后，SW116细胞凋亡明显上升，不同剂量五味子乙素均能诱导细胞的凋亡，随着药物浓度的升高，细胞的凋亡率也逐渐增加，表现出浓度依赖性。五味子乙素可以明显抑制大肠癌SW116细胞株的增殖。见图1、表2。

图1 五味子乙素对SW116细胞凋亡的影响

表2 五味子乙素对SW116细胞凋亡率的影响

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，&P<0.05

2.3 五味子乙素对凋亡蛋白表达的影响 不同剂量五味子乙素对SW116细胞处理干预24 h后，采用免疫印迹技术对细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平检测,结果如图2所示。结果表明，五味子乙素可以明显诱导促凋亡蛋白Bax的表达，随着五味子乙素剂量的升高,Bax表达水平也随之升高，与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)；而五味子乙素可以明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，随着药物浓度升高，Bcl-2表达水平降低，与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 五味子乙素对Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，&P<0.05

2.4 五味子乙素对PI3K/Akt通路蛋白表达的影响 不同剂量五味子乙素对SW116细胞处理干预24 h后，采用免疫印迹技术对细胞中PI3K/Akt信号通路活化情况进行检测，结果如图3所示。结果表明，五味子乙素可以明显抑制PI3K、p-Akt蛋白水平，随着五味子乙素剂量升高，PI3K、p-Akt蛋白表达水平降低，与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)；而Akt蛋白表达水平则没有发生明显的变化。说明五味子乙素可以通过抑制PI3K/Akt信号通路活化达到诱导SW116细胞凋亡的效果。

图3 五味子乙素对PI3K/Akt信号通路的影响

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，&P<0.05

3 讨论

大肠癌在肿瘤死亡率中占据较高的比例，其治疗方法主要为手术、放疗及靶向治疗等，然而该疾病的临床治疗效果并不明显，术后5年生存率为60%，而出现转移灶后患者的5年生存率仅为10%[14]。因此，找到一种新的治疗大肠癌的方法至关重要。前期较多文献报道，中药具有改善疾病症状、提高免疫力、结合放化疗增敏减毒、减少复发转移等功效；并且中药在大肠癌的治疗中也表现出较好的临床效果[15]。中药单体五味子乙素是从五味子中提取得到的活性成分，并且其具有较好的抗癌活性，尤其对膀胱癌、胃癌及乳腺癌等肿瘤的抑制效果较为显著。但五味子乙素对大肠癌SW116细胞的增殖、凋亡等作用及其作用的有关机制尚未得到很好的证实。本研究结果表明，五味子乙素能够明显抑制SW116细胞的增殖，诱导其凋亡。

PI3K信号通路活化介导肿瘤的发生，并且研究证实，PI3K/Akt信号传导通路在细胞增殖、分化、肿瘤的血管形成等方面发挥着重要作用[16]。还有报道提出，PI3K/Akt信号传导与肿瘤的多药耐药关系密切[17]。在PI3K信号传导过程中，当上游信号作用细胞膜表面时，会引起酪氨酸激酶自身磷酸化或磷酸化其他作用底物，可在细胞膜内表面产生PI3K结合位点，激活下游的Akt磷酸化，进而活化或抑制其下游靶基因介导细胞增殖、分化、凋亡、迁移及侵袭的调控。本研究结果显示，五味子乙素能明显抑制PI3K/Akt信号通路的活化，主要通过抑制PI3K和p-Akt蛋白的表达，说明五味子乙素可以通过调控PI3K/Akt信号通路介导SW116细胞的凋亡。Bcl-2、Bax在细胞凋亡调控过程中起着十分重要的作用。Bax是一种促凋亡蛋白，而Bcl-2是一种抗凋亡蛋白。本研究发现，五味子乙素可以明显诱导Bax表达，抑制Bcl-2表达，进一步诱导SW116细胞凋亡。

综上所述，五味子乙素能够明显抑制大肠癌SW116细胞的增殖，促使其凋亡，其机制可能与五味子乙素下调PI3K/Akt信号通路活化有关，继而启动细胞凋亡。

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