赵 楠，辛 华，张乐宁，聂海英

(吉林大学中日联谊医院 胸外科，吉林 长春130033)

肺癌血行转移是一个高度选择性的非随机生物学过程，包括肺癌细胞与血管内皮细胞及细胞外基质之间一系列复杂的生物学作用。其中肺癌细胞向血管外游走是肺癌血行转移的重要步骤。为此，我们在体外模拟构建了肺癌细胞血行转移中的血管外游走过程，并对肺癌细胞的血管外游走状况加以探讨。

1 材料与方法

1.1 实验所用细胞

在包被有明胶的细胞培养皿上培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)；4种肺癌细胞分别为：VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ。

1.2 血管内皮单细胞层的制备

将3×104个HUVEC加入预先制备胶原凝胶层的细胞培养皿内[1]，培养1周，将细胞培养皿放入装有正负电极的培养容器内，与电阻测定仪相连，记录血管内皮单细胞层的电阻值。

1.3 肺癌细胞血管外游走实验

制成血管内皮单细胞层后，分别将1×105个肺癌细胞(VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ)加入细胞培养皿内；分别在血管内皮单细胞层上加入肺癌细胞1 h、3 h、6 h、12 h后除去细胞培养液，将胶原凝胶层及其表面的细胞完整取出，石蜡包埋，制成组织切片，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining)后在光镜(100×)下分别观察各种肺癌细胞与HUVEC粘附及游走至胶原凝胶中的状态，同时记录单位长度(5 mm)中穿过HUVEC游走至胶原凝胶中的肺癌细胞数量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 血管内皮单细胞层的确认

血管内皮单细胞层的电阻值为9.68±2.05 ohm/cm2，与相关研究报道的数值基本一致[2]，可以认为HUVEC已完全融合生长，在胶原凝胶表面制备成血管内皮单细胞层。

2.2 各种肺癌细胞的血管外游走状况

分别在血管内皮单细胞层上加入肺癌细胞(VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ)1 h、3 h、6 h、12 h后，观察肺癌细胞与HUVEC粘附及游走至胶原凝胶中的状况。我们观察到LK-2、A549、RERF-LC-KJ能够穿过血管内皮单细胞层游走浸润至胶原凝胶层(图1)，伴随时间的推移游走至胶原凝胶中的细胞数量也越来越多；发现VMRC-LCD与LK-2、A549、RERF-LC-KJ不同，它几乎不与血管内皮细胞发生粘附，也更不能穿过血管内皮细胞游走浸润至胶原凝胶层(图2)；分别观察不同时间段穿过血管内皮单细胞层游走至胶原凝胶中的肺癌细胞数，LK-2均较A549、RERF-LC-KJ更多地游走至血管外，差异有统计学意义(P<0.05)，证明了与A549、RERF-LC-KJ相比LK-2具有更强的穿过血管内皮的能力(表1)。

图1 肺癌细胞的血管外游走状况(LK-2)

图2 肺癌细胞VMRC-LCD的血管外游走状况

VMRC-LCDRERF-LC-KJA549LK-21 h03.65±1.213.17±1.157.26±2.18∗3 h09.06±2.3510.62±3.8236.07±9.85∗6 h021.87±7.3120.69±6.5857.93±11.37∗12 h043.92±11.1740.53±11.64102.74±18.64∗

注：*LK-2与VMRC-LCD、A549、RERF-LC-KJ相比P<0.05(n=6)

3 讨论

肺癌血行转移是一个高度选择性的非随机生物学过程，包括肺癌细胞与血管内皮细胞及细胞外基质之间一系列复杂的生物学作用。大部分进入血液循环的肺癌细胞受到机体的免疫系统杀灭和血流的破坏，残余的很小一部分肺癌细胞到达转移靶器官后会停滞在微血管中，与血管内皮细胞相互作用，穿过血管内皮，游走至血管外，形成转移灶。

肺癌的血行转移具有器官组织特异性，按发生率递减的顺序，容易出现转移的器官有脑、骨骼、肝脏、肾上腺。这是因为进入血液循环的肺癌细胞在靶器官穿过血管内皮的前提是肺癌细胞与血管内皮细胞的特异性粘附[3]。这种特异性粘附的分子基础是靶器官的内皮细胞及细胞外基质所表达的粘附分子。粘附分子(adhesion molecules)是介导细胞之间及细胞与细胞外基质间粘附作用的一类糖蛋白，与肿瘤细胞的侵袭及血行转移密切相关。根据粘附分子的结构和功能，可分为:选择素(selectins)、钙依赖粘合蛋白(cadherins)、整合蛋白(integrins)、透明质酸受体家族(hyaluronic acid receptor family)、免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily)及CD44、血管细胞粘附分子VCAM-l、PECAM-l(CD31)等。这些粘附分子大部分为分布在细胞膜表面的跨膜糖蛋白，还有少部分脂质。所有的粘附分子都是以配体-受体相互作用的形式发挥其生物学效应[4]。实验中我们证实肺癌细胞VMRC-LCD与其他的肺癌细胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)不同，它几乎不与血管内皮细胞相粘附，更不能穿过内皮细胞游走至胶原凝胶中，这说明VMRC-LCD可能不表达与血管内皮细胞相对应粘附分子的配体。

肺癌细胞与靶器官的血管内皮细胞粘附着床后的下一步就是穿过血管内皮游走至血管外。实验中我们证实肺癌细胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿过HUVEC单细胞层游走至胶原凝胶中，并发现在不同的时间段，LK-2均较A549、RERF-LC-KJ更多地游走至血管外，这说明与A549、RERF-LC-KJ相比LK-2具有更强的穿过血管内皮的能力。但肺癌细胞是如何进行血管外游走的目前尚未完全阐明，希望通过我们的研究能够初步揭示肺癌细胞的血管外游走状况，并为以后的研究打下基础。

参考文献：

[1]Xin H,Han ZG.Functional regulation of endothelial Myosin light chain kinase in extravascular migration of fibrosarcoma cells[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2009,38(2):145.

[2]Han CS,Xin H,Han ZG,et al.Effect of tissue factor in extravascular migration of fibrosarcoma cell[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2011,40(2):245.

[3]Kawaguchi T.Organ Preference of Cancer Metastasis and Metastasis- Related Cell Adhesion Molecules Including Carbohydrates[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2016,15(3):164.

[4]Yousefi M,Bahrami T,Salmaninejad A,et al.Lung cancer-associated brain metastasis:Molecular mechanisms and therapeutic options[J].Cell Oncol (Dordr),2017,40(5):419.