王启船,王 青,万里新,屈中玉,赵得堡,朱 昆

(1.南阳市中心医院 肿瘤1科,河南 南阳473009;2.南阳市中心医院 供应室二部,河南 南阳473009; 3.吉林大学中日联谊医院 药学部,吉林 长春130033)

肺癌是世界范围内发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占到80%以上，且绝大部分确诊时已到晚期，5年生存率低于10%[1]。寻找一种高特异性与敏感性的分子标志物以提高NSCL早期诊断治疗、改善患者预后就显得尤为重要[2，3]。相关研究表明，微小RNA是一种高度保守的非编码单链小分子RNA，在NSCLC分化、浸润与转移中发挥着重要的作用[4]。微小RNA-204(miR-204)作为一种新的致癌基因或抑癌基因，在鼻咽癌、肝癌等肿瘤组织均为明显低表达状态，且与肿瘤分期及预后明显相关[5，6]，也有学者报道miR-204可通过抑制肿瘤细胞A549的增殖发挥抗肿瘤作用[7]，但目前还少有对癌细胞H252影响的文献报道。基于此种背景，本文通过细胞转染与细胞增殖实验的方法，分析miR-204在NSCLC中的表达及对H252癌细胞增殖与凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月-2016年12月医院手术治疗的NSCLC患者72例肺癌及相应癌旁组织(距肺癌组织>5 cm)标本，男38例，女34例；年龄43-72岁，平均(55.36±6.12)岁；TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期28例，Ⅲ期24例，Ⅳ期8例。排除术前放化疗或分子靶向治疗者，经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。标本切除后立即保存于液氮中，随后转入-80℃冰箱保存，整个操作过程遵循无酶原则。

1.2 细胞与主要试剂

人非小细胞肺癌H252细胞株：中科院上海生物研究所细胞库；F-12K培养基与胎牛血清：美国Gibco公司；RNA提取盒、逆转试剂盒：美国Omega公司；Marke、SYBR实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒：大连宝生物工程有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒：美国BD公司；miR-204模拟物、miR-204抑制物、miR-204及U6 引物：上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1细胞培养与转染 非小细胞肺癌H252细胞细胞株使用含10%胎牛血清的F12K培养基常规培养，培养条件：370C、5%二氧化碳培养箱。参照Lipofectamine 3000说明书，转染分为对照组、阴性对照组、miR-204模拟组、miR-204抑制组，将各组转染物转染入H252细胞。

1.3.2细胞增殖实验 取转染48 h后细胞，按照100 μl/孔(约含1×104个细胞)接种到96孔培养板中，培养24、48、72 h、96 h后，每孔(每组6个平行孔)加入μlCCK-8试剂，继续培养4 h，于450 nm波长酶标仪上检测各孔吸光度，重复3次，取各孔平均值作为细胞相对增殖水平。

1.3.3细胞凋亡检测 细胞转染培养48 h，取1×105个细胞，800 r/min离心5 min弃上清液，加入0.5 ml结合液重悬细胞使细胞密度达到1×105个细胞/ml，随后加入Annxin V-FITC(5 μl)混匀，避光室温孵育15 min。加Propidium Iodide(5 μl)混匀，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，重复3次，计算凋亡率。

1.3.4实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) RNA提取采用Trizol法，将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR。反应条件：95℃预变性30 s，95℃5 s，60℃ 60 s，共40个循环。采用2△△Ct法计算相对表达水平：△CtmiR-204-CtU6，△△Ct=△CtT-△CtN。miR-204、U6引物系列见表1。

表1 miR-204、U6基因qRT-PCR引物系列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 肺癌组织及正常组织miR-204相对表达比较

肺癌组织miR-204的mRNA相对表达水平为(2.38±0.42)，癌旁组织miR-204的mRNA相对表达水平为(5.46±0.54)。肺癌组织miR-204的mRNA相对表达水平明显低于癌旁组织mRNA相对表达水平(t=11.028,P<0.01)。

2.2 不同临床特征患者miR-204相对表达比较

不同性别、年龄患者miR-204相对表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；Ⅲ-Ⅳ期、肿瘤直径≥3 cm、淋巴结发生转移肺癌患者miR-204相对表达明显低于Ⅰ-Ⅱ期、肿瘤直径<3 cm、淋巴结未发生转移者(P<0.05,P<0.01)。见表2。

2.3 miR-204对人H252细胞增殖与凋亡的影响

对照组、阴性对照组、抑制物组、模拟物组miR-204的mRNA相对表达水平为(2.36±0.45)、(2.21±0.42)、(1.02±0.24)、(4.01±0.54)，四组间比较，差异有统计学意义(F=9.124,P<0.01)；模拟物组miR-204的mRNA相对表达水平明显高于阴性对照组、抑制物组(t=6.299,11.619,P<0.05,P<0.01)。

24 h，对照组、阴性对照组、抑制物组、模拟物组4组H252细胞增殖水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；48 h、72 h、96 h，与阴性对照组比较，抑制物组H252细胞增殖水平明显升高，模拟物组H252细胞增殖水平明显降低(P<0.05,P<0.01)，与抑制物组比较，模拟物组H252细胞增殖水平明显降低(P<0.01)。见图1。

表2 不同临床特征患者miR-204相对表达水平比较

与阴性对照组比较，抑制物组H252细胞凋亡率明显降低，模拟物组H252细胞凋亡率明显升高(P<0.05,P<0.01)；与抑制物组比较，模拟物组H252细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。见图2。

3 讨论

随着蛋白组学与基因水平研究的不断深入，NSCLC发病机制、早期诊断、靶向治疗越来越受到学者的关注。表皮因子受体(EGFR)是公认有效抗癌靶点[8]，Zhen等[9]研究认为miRNAs可能在靶向EGFR治疗中发挥着重要的作用。相关研究表明，miRNAs可通过抑制转录过程调控基因表达，参与肿瘤的发生、发展过程[10]。能够通过直接或间接方式抑制ERK1/2、AKT、STAT3表达，进而阻断EGFR信号通路[11]；miR-134可竞争性结合EGFR3’-URT，抑制EGFR信号通路活性，促进癌细胞凋亡[12]。

图1 miR-204对人H252细胞增殖的影响

图2 miR-204对人H252细胞凋亡的影响

MiR-204编码基因位于人类染色体7q32，在脊椎动物中为一种高度保守的成熟序列[13]，作为一种新的致癌基因与抑癌基因，广泛参与肿瘤发生、发展与侵袭过程[14]。如MiR-204高表达可诱导前列腺衍生上皮因子(PDEF)失控刺激前列腺癌发生[15]，低表达与人肾黎明细胞癌(RCCC)恶性临床病理特征明显相关[16]。蒋义成等[17]研究发现，鼻咽癌患者肿瘤组织miR-204呈明显低表达状态，且与TNM分期、淋巴结转移明显相关。本文研究中，NSCLC肿瘤组织miR-204相对表达水平明显低于癌旁组织，且Ⅲ-Ⅳ期、肿瘤直径≥3 cm、淋巴结发生转移肺癌患者miR-204相对表达明显低于Ⅰ-Ⅱ期、肿瘤直径<3 cm、淋巴结未发生转移者，与李丽霞等[18]文献报道基本相似，提示miR-204的表达水平与NSCLC恶性病理行为明显相关。

许有忠等[19]等通过细胞转染与增殖实验报道，转染miR-204模拟物组A-549细胞增殖水平明显低于阴性对照组、抑制物组，认为miR-204作为一种抑癌基因可抑制NSCLC肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。H252作为肿瘤细胞家族一员，也是反应NSCLC恶性程度的有效指标[20]。本文研究中，通过对照组、阴性对照组、抑制物组、模拟物组分组实验，48 h、72 h、96 h，模拟物组H252细胞增殖水平明显低于阴性对照组、抑制物组，H252细胞凋亡率明显高于阴性对照组、抑制物组。所得结论也支持上述文献观点。

本文研究结果表明，非小细胞肺癌组织miR-204呈明显低表达状态，与TNM分期、肿瘤直径、淋巴结转移等恶性病理行为明显相关。miR-204能抑制H252癌细胞增殖，促进细胞凋亡。但其作用机制尚不十分清楚，有待于更多的基础研究与临床研究去证实。

作者简介：王启船(1975-)，男，硕士，副主任医师，主要从事肿瘤内科及肿瘤微创治疗。

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