戴红伟 周 娇

（湖北医药学院附属随州医院，湖北省随州市中心医院，湖北 随州 441300）

急性淋巴细胞白血病（ALL）为一类造血干细胞的分化和成熟异常的克隆性疾病。流行病学显示，ALL约占儿童急性白血病总病例的80%，成年人约占20%，3～7岁儿童为ALL好发人群。儿童ALL经化疗后90%以上可完全缓解，其5年无病生存率达70%～80%，但成人化疗疗效较差，5年生存率不到40%［1］。ALL患者因血小板的质与量异常或白血病细胞对血管壁的浸润性损害使渗透性增加，常因严重的出血导致贫血和感染，但也偶有出血后发生弥散性血管内凝血（DIC），导致这一现象可能与原始ALL细胞释放凝血酶、激酶等物质有关。在ALL的病理进程中，造血干细胞主要起源于T系或B系淋巴祖细胞，当这些细胞出现恶性分裂增殖并取代正常细胞后，骨髓的正常成分被恶性细胞取代而发生凝血功能障碍，并最终因DIC而死亡［2］。故如何纠正凝血功能障碍，防止DIC是挽救患者生命的重要手段。近年来随着分子生物学快速发展和完善，对白血病的分类更加精准，中药的有效药理成分在抑癌防癌方面有长足的发展，极大提高了白血病临床疗效。槲皮素为壳斗科植物伊比利亚栎的皮和叶中提取的苷类化合物，除具有介导细胞信号传导、抑制炎性介质表达及抗肿瘤等作用外，还具有抑制血小板活化因子及凝血酶等诱导的血小板聚集作用［3-4］。因槲皮素对ALL凝血功能鲜有深入的活体研究，为降低ALL化疗时的严重不良反应及耐药性，防治DIC，本研究以槲皮素和ALL模型小鼠为研究对象，观察和分析其对凝血功能的影响，以期为其用于临床辅助治疗ALL提供实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 NOD/SCID小鼠60只，雌雄不拘，6～7 周龄，体质量（19.5±1.5） g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2017-019］。将小鼠用随机数字编号后随机分为空白对照组、双香豆素组、模型对照组、槲皮素0.75 mg/kg组、1.5 mg/kg组与3 mg/kg组各10只。

1.2 试剂及仪器 槲皮素 （北京索莱宝科技有限公司）；双香豆素（上海鼓臣生物技术有限公司）；Nalm-6细胞（上海酶联生物科技有限公司）；鼠抗人P-选择素（P-selectin）、血管黏附分子-1（VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（ICMA-1）单克隆抗体及检测试剂盒（上海沪震实业有限公司）；LC-2900型高效液相色谱仪 （上海天普分析仪器有限公司）；Berthold LB 942微孔板多功能酶标仪（北京原平皓生物技术有限公司）。

1.3 模型制备 将Nalm-6细胞37℃条件下解冻，然后接种于RPMI-1640培养基，放在通5%CO2气体、37℃培养箱中恒温培养，待Nalm-6细胞呈对数生长期时，提取并调制成细胞总数为5×106个/mL的悬液。除空白对照组外均用5×106个Nalm-6细胞 （0.1 mL/鼠）尾静脉注射建立ALL模型［5］。成模标准参考文献［6］：在注射造模2周后，小鼠出现体质量减轻、后肢瘫痪等症状并伴有肝脾增大、病检显示白血病细胞在肝脾及骨髓中弥漫性浸润、静脉血白细胞达（4.03±1.92）×109/L。

1.4 给药方法 在注射造模2周后，空白对照组和模型对照组腹腔注射0.9%氯化钠注射液 （0.2 mL/只）作为阴性对照，双香豆素组腹腔注射双香豆素（1.5 mg/kg）作为阳性对照，槲皮素0.75 mg/kg组、1.5 mg/kg组和3 mg/kg组按相应剂量给予槲皮素腹腔注射治疗，每组均每日1次腹腔注射，治疗3周。

1.5 标本采集与检测 1）出、凝血时间及血小板3H-5HT释放实验。治疗结束后剥除小鼠眼球，吸取0.2 mL静脉血储存于无热原、无内毒素试管并编号备用。取血后采用玻片法和断尾法观察凝血时间（CT）和出血时间（BT）［7］。 高效液相色谱荧光法检测血小板中 3H-5HT水平。2）双抗体夹心法检测ICMA-1、VCAM-1和P-selectin蛋白表达。取3组治疗前后备用的静脉血，于室温放置，4℃过夜，1000×g离心20 min，取上清，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或各组待测上清100 μL，轻轻晃动混匀。酶标板覆膜，37℃孵育90 min。弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100 μL（在使用前15 min内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，大约每孔350 μL，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加酶结合物工作液 （临用前15 min 内配制）100 μL， 加上覆膜，37 ℃温育 30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液（TMB）90 μL，酶标板加上覆膜 37℃避光孵育 15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。使用curve expert 1.3专业曲线制作软件分析，将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式计算出样品浓度。3）凝血因子生成实验。凝血酶、内/外源性凝血因子Xa生成量测定参照文献［8］。取3组治疗前后备用的静脉血，取上述全血105个全血细胞，加入含5 mmol/L CaCl2、1 nmol/L 因子Ⅸa、0.2 mmol/L 凝血酶（Ⅱa）、5 nmol/L因子Ⅷ和130 nmol/L因子X的缓冲液共孵育10min，用7mmol/L的EDTA终止；加入0.8mmol/L显色底物，用酶标仪在405 nim波长处测定内源性因子Ⅹa的生成量。将取上述全血105个全血细胞与含5 mmol/L CaCl2、130 nmol/L因子Ⅹ和1 nmol/L因子Ⅶa的缓冲液中共孵育10 min，用7 mmol/L的EDTA终止，然后加入0.8 mmol/L的显色底物测定外源性因子生成量。将105个全血细胞加入含5 mmol/L CaCl2、1 nmol/L因子Ⅴa、0.05 nmol/L因子Ⅹa、1 nmol/L凝血酶原的缓冲液中共孵育10 min，用7 mmol/L的EDTA终止；加入0.8 mmol/L的S2238，用酶标仪在405 nim波长处测定凝血酶生成量。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件处理。计时资料以（±s）表示，多组间先进行方差分析，组间两样本均数采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组P-selectin和黏附分子蛋白表达比较 见表1。经抗体夹心法检测，模型对照组P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表达水平明显升高，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。双香豆素组与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。槲皮素组呈剂量依赖性降低 P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表达，其中槲皮素3 mg/kg组与模型对照组、1.5 mg/kg组和0.75 mg/kg组比较差异有统计学意义（P＜0.05），1.5 mg/kg组与模型对照组和0.75 mg/kg组比较差异有统计学意义（P＜0.05），。

2.2 各组凝血功能比较 见表2。模型对照组血小板3H-5HT、凝血酶、内/外源性凝血因子Ⅹa的生成增多，CT和BT均进一步缩短，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。双香豆素组血小板3H-5HT、凝血酶、内/外源性凝血因子Ⅹa的生成减少，CT和BT均延长，与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。槲皮素组呈剂量依赖性降低凝血酶、内/外源性凝血因子Ⅹa的生成，抑制血小板3H-5HT释放并延长CT和BT时间，其中槲皮素3 mg/kg组与模型对照组、1.5 mg/kg组和0.75 mg/kg组比较差异有统计学意义（P＜0.05），1.5 mg/kg组与模型对照组和0.75 mg/kg组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。但槲皮素组对上述指标的作用均弱于双香豆素。

表1 各组静脉血P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表达比较（pg/mL，±s）

表1 各组静脉血P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表达比较（pg/mL，±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与槲皮素 0.75 mg/kg组比较，◇P＜0.05；与槲皮素 1.5 mg/kg组比较，▲P＜ 0.05。下同。

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表2 各组凝血功能比较（±s）

表2 各组凝血功能比较（±s）

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3 讨 论

槲皮素又名槲皮黄素、栎精，大多数植物的花、叶、果实中均有以苷形式存在的槲皮素，其中以芦丁、栎树中含量较高。槲皮素具有抗氧化、清除氧自由基活性、对肿瘤具有周期阻滞于G0/M期等作用，还具有抑制炎性介质表达、显著抑制白血病患者血小板释放作用［9-11］。

P-selectin是血小板颗粒表面的一种膜蛋白，在生理情况下其较少表达，但当血小板被凝血酶激活后，P-selectin随即暴露于胞浆表面，发挥介导内皮细胞、活化血小板与白细胞的相互作用，并促使内皮细胞释放组织因子，启动凝血反应，其水平增加说明体内血小板活化程度相应增强［12］。ICAM-1和VCAM-1属于免疫球蛋白，为重要的血管和细胞间的黏附分子。ICAM-1参与淋巴细胞的分化，为T淋巴细胞活化的共刺激信号之一，在免疫效应细胞识别和杀伤方面发挥增强作用［13-14］。VCAM-1在白细胞穿越血管壁到达炎症部位的过程中发挥重要作用，并参与细胞与基质相互识别与黏附［15］。故在 ALL 凝血功能中，P-selectin、VCAM-1和ICMA-1相互作用，与ALL的发生、发展及预后密切相关［16］。在本实验中，双抗体夹心法测定显示槲皮素组呈剂量依赖性降低血小板P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表达，这提示槲皮素对P-selectin、VCAM-1和ICMA-1均有明显的抑制作用。槲皮素可能通过抑制P-selectin、VCAM-1和ICMA-1使细胞与基质间黏附力降低，阻止过于活化T/B淋巴细胞，以减轻其对血管内皮的损伤，间接避免因血管内皮损伤激活内源性凝血引发DIC。

ALL患者存在B、T或成熟B淋巴细胞发生克隆性异常增殖，这些异常活跃的TB淋巴祖细胞除对肝、脾、淋巴等器官和组织广泛浸润外，还会造严重影响到凝血功能，造成出血和凝血异常，患儿短期内即可能死亡［17］。体内存在有内源性及外源性两种激活系统。前者是指心血管内膜受损，或血液流出体外通过与异常表面接触而激活因子Ⅻ（Hageman factor）。后者则由于组织损伤释放出因子Ⅲ，从而激活因子Ⅶ。两者都能启动一系列连锁反应，并在因子Ⅹ处汇合，最后都导致凝血酶原的激活及纤维蛋白的形成。正常生理状态下，机体整个凝血过程大致上可分为凝血酶原的激活及凝胶状纤维蛋白的形成两个阶段。首先，激活的因子Ⅹ与因子Ⅴ、磷脂及Ca2+形成复合物并将凝血酶原激活为凝血酶。凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的双重生物学特性。凝血酶是由在凝血酶原复合物中的非活性凝血酶原在凝血因子Xa的作用下通过蛋白裂解的方式产生，当循环凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白而产生凝血作用，即外源性凝血被激活［18］。凝血因子Xa刺激后产生了有活性的血小板样颗粒并促使巨核细胞分化为血小板［19］。另外，在血栓形成的同时，血小板释放3H-5HT、血液凝固因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅻ等多种活性物质激活周围血小板，促进血管收缩，促纤维蛋白形成。在本实验中，槲皮素组呈剂量依赖性降低凝血酶、内/外源性凝血因子Xa的生成，抑制血小板3H-5HT释放并延长CT和BT时间，说明槲皮素在凝血过程中，通过抑制上述凝血相关因子的产生而纠正凝血功能障碍，防止DIC的发生。

总之，槲皮素可能通过抑制P-selectin、VCAM-1和ICMA-1等与血小板和细胞黏附分子蛋白表达而降低血小板及细胞间的黏附性，并通过干预ALL内/外源性凝血而纠正凝血功能障碍，可在一定程度上减弱白血病细胞的促凝血效应。

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