苏琼　宋建新

【摘要】 目的：探討慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓M2型巨噬细胞与白血病干细胞（leukemic stem cells，LSC）的相关性，并明确其意义。方法：采用免疫组织化学染色法检测CML慢性期（CML-CP）30例、加速期（CML-AP）21例、急变期（CML-BP）15例、经治疗后缓解患者44例（缓解组）、未缓解患者7例（未缓解组）及30例缺铁性贫血患者（对照组）骨髓组织中CD163+的表达变化，比较M2型巨噬细胞在CML患者不同时期骨髓组织中的表达差异；用流式细胞仪检测相应CML各期CD34+CD38-CD123+ LSC的表达，并与正常对照组进行比较。结果：CML各组患者骨髓中CD163+巨噬细胞有不同程度的表达，与对照组相比明显增高（P<0.05）。随着病情的进展，CD163+巨噬细胞的浸润密度逐渐增高，CML-BP高于CML-AP（P<0.05），CML-AP高于CML-CP（P<0.05），缓解组CD163+均有所降低，但仍高于对照组（P<0.05），未缓解组与CML-BP相比有增高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。在CML-CP患者中，CD34+CD38-CD123+细胞明显高于对照组（P<0.05），随着病情进展，表达逐渐增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP，且组间差异有统计学意义（P<0.05）；患者经治疗完全缓解后，CD34+CD38-CD123+细胞表达有所降低，但仍高于对照组（P<0.05）；未缓解组CD34+CD38-CD123+细胞有增高趋势，但与CML-BP相比无统计学意义（P>0.05）；经相关性分析，CD163+巨噬细胞浸润密度与LSC阳性细胞数呈明显正相关（P<0.05）。结论：M2巨噬细胞在CML患者骨髓中具有较高的浸润密度，且在CML不同时期浸润密度不同；CD34+CD38-CD123+细胞在不同时期的CML中均有不同程度表达。M2型巨噬细胞与LSC可能通过直接或间接作用，参与CML的发生、发展及预后。有望为CML的发生、发展机制、治疗及预后判断提供新的思路和理论依据。

【关键词】 慢性粒细胞白血病； 巨噬细胞； CD163+； LSC

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.6.001 文献标识码 A 文献标识码 1674-6805（2018）06-0001-04

Correlation Study of M2 Macrophages and Leukemic Stem Cells in Bone Marrow of Patients with Chronic Myeloid Leukemia/SU Qiong，SONG Jianxin.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（6）：1-4

【Abstract】 Objective：To discuss the correlation between bone marrow M2 macrophages in chronic myelogenous leukemia（CML） patients and leukemic stem cells（leukemic stem cells，LSC） and to clarify bone marrow macrophages role in CML patients.Method：The expression of CD163+ in bone marrow was detected by immunohistochemical staining in chronic phase（CML-CP） 30 cases，accelerated phase（CML-AP） 21 cases，blastic phase（CML-BP） 15 cases，remission patients 44 cases after treatment，no remission patients with 7 cases and 30 cases of iron deficiency anemia patients.Flow cytometry was used to detect CD34+CD38-CD123+ LSC.Result：There were different expression levels of CD163+ in CML patient bone marrow.Compared with normal control，the expressions in CML patients were significantly high.With the patient progress，CD163+ infiltration density gradually increased.The infiltration density in CML-BP group was higher than that in CML-AP group（P<0.05），the density in CML-AP group was higher than that in CML-CP group（P<0.05），the density in remission patients was low，and was still higher compared with normal control（P<0.05）.There was increase trend in without remission group compared with CML-BP group（P>0.05）.The number of CD34+CD38-CD123+ positive cells in CML-CP patients was significantly higher than in normal control（P<0.05）.With the progress of the disease，the expression gradually increased，the CML-BP> CML-AP> CML-CP，and there were statistical significance between groups（P<0.05）.CD34+CD38-CD123+ cells in completed remission group were decreased and were still higher than normal control（P<0.05）.There was no statistical significance in without remission group compared to AP.After correlation analysis，CD163+ macrophage infiltration density was positively correlated with LSC-positive cells（P<0.05）.Conclusion：Macrophages have higher infiltration density in CML different phases and gradually polarized to M2 macrophages.Infiltration density is different in different CML phages.CD34+CD38-CD123+ are different expression levels in CML different phases.M2 macrophages closely relate to CML occurrence，development and prognosis.It can supply new ideas and theoretical basis for CML treatment and prognosis judgment.

【Key words】 Chronic myelogenous leukemia； Macrophages； CD163+； LSC

First-authors address：The Peoples Hospital of Chuxiong，Chuxiong 675000，China

骨髓微环境是一个有序的复杂结构，不仅提供造血细胞赖以生存、发育及分化的场所，同时其改变也为血液系统恶性肿瘤提供了一个合适的生存空间。巨噬细胞（macrophages）作为骨髓微环境的一重要成分，在炎性组织中主要参与组织重建、炎症和免疫，保护机体对抗感染及损伤；而在某些特定的细胞因子作用下可活化为具有不同表型和功能的巨噬细胞，参与肿瘤的生存、增殖、浸润、转移并与预后不良相关[1]。白血病干细胞（leukemic stem cells，LSC）是白血病患者体内持续存在的一群微量、相对惰性、具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，其在白血病的发生、发展、化疗耐药和复发中起着重要的作用。研究表明，经治疗达完全细胞遗传学缓解的CML患者体内仍残留有107个左右包括LSC在内的白血病细胞，这些微小残留LSC是CML不能被最终治愈和复发的根本原因[2]。因此如何恢复患者机体乃至骨髓微环境的免疫功能，可能是抑制LSC增殖，清除白血病微小残留，最终治愈白血病的有效方法之一。本文通过免疫组织化学染色，观察初诊CML慢性期（CML-CP）、加速期（CML-AP）、急变期（CML-BP）、缓解及未缓解患者骨髓微环境中CD163+（M2）型巨噬细胞浸润程度；以CD34+CD38-CD123+作为识别LSC的免疫表型，利用流式细胞术检测不同时期CML患者骨髓中是否存在免疫表型为CD34+CD38-CD123+的LSC，探讨骨髓微环境中浸润的巨噬细胞类型变化、浸润密度与LSC的相互关系及在CML发生、发展的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

66病例均来自笔者所在医院血液科门诊及住院患者，男42例，女24例，中位年龄56岁（18～78岁），经骨髓细胞形态、细胞遗传学及分子生物学检查，符合文献[3]CML各期的诊断标准。其中，CML-CP 30例，CML-AP 21例，CML-BP 15例（6例为急淋变，其余为急髓变）。经治疗后完全缓解44例，未缓解7例，其中，CML-CP除7例失访外全部完全缓解，21例CML-AP患者中，完全缓解13例，未缓解3例，5例转外院治疗而失访；CML-BP完全缓解8例，未缓解4例，治疗中1例死亡，2例转外院失访。30例缺铁性贫血患者作为对照组，其中，男18例，女12例；中位年龄54.5岁（18～76岁）。本研究获笔者所在医院伦理委员会批准，并征得所有受试者知情同意。

1.2 主要试剂与仪器

鼠抗人CD163单克隆抗体，SP免疫组化试剂盒购自美国Abcam公司；CD45-ECD、CD34-PE-Cy5、CD123-PE、CD38-FITC及同型对照购自BD公司。流式细胞仪为Beckman Coulter公司 FC500。

1.3 免疫组化检测CD163+在骨髓组织中的表达

常规骨髓穿刺取骨髓组织，置于10%福尔马林液固定液中交笔者所在医院病理科进行脱水、石蜡包埋处理。取骨髓活检组织的石蜡块，切3～4 μm厚的切片；采用S-P免疫组化染色检测CD163+的表达。染色步骤为：二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液轻洗3次，进行抗原微炉热修复，正常山羊血清封闭、滴加一抗，4 ℃孵育过夜；PBS缓冲液轻洗3次，滴加二抗，室温孵育10 min，PBS缓冲液轻洗3次；滴加DAB显色，显微镜下控制显色时间在10～15 min，自来水冲洗，苏木素复染胞核，脱水透明，中性树胶封片。对照组用PBS替代一抗，其余步骤相同。

1.4 免疫组化染色结果判定

巨噬细胞体积较大，形态多样，呈类圆形或不规则形，偶见有多核细胞；经染色CD163+主要在细胞膜着色，有黄褐色或棕黄色沉着物为阳性。先在低倍镜（×100）下选取5个染色较好的视野，后在高倍镜下（×400）计数阳性细胞数[4]，取其平均值进行统计学分析。

1.5 LSC表型檢测

采用细胞直接标记方法，取初诊CML患者骨髓2 ml，EDTA抗凝备用。调整待测样品白细胞计数在（1.0～2.0）×105/L，用微量移液器吸取EDTA抗凝的新鲜骨髓各100 μl于2支流式细胞仪专用试管中，一管是同型对照管，另一管是测定管；于对照管中加入IgG1-PE、IgG2a-FITC、IgG1PE-Cy5、CD45-APC四个抗体各20 μl。测定管加入CD34-PE-Cy5、CD123-PE、CD38FITC、CD45-APC四种个抗体各20 μl，摇匀，室温下避光孵育30 min。每管加入1×溶血素2 000 μl，摇匀，避光10～15 min至完全溶血。溶血后，每管加入1×PBS 1 000 μl混匀，1 500 r/min离心8 min，弃上清液；加入500 μl PBS摇匀上机测定，每管收集10 000个细胞。

1.6 白血病干细胞的确认

用侧向角散射光SSC/CD45设门，将细胞分出淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞群，再以SSC/CD34设门后分析CD34+细胞中CD38-CD123+抗原的表达百分比。所得的百分比数值乘以之前所测得的CD34+细胞的百分比值即为CD34+CD38-CD123+占所有有核细胞的百分比[5]。

1.7 统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件进行分析。数据以（x±s）表示，各组中CD68、CDl63浸润密度及LSC阳性表达率用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。应用Pearson分析CD163+与LSC的相关关系，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD163+在对照组及CML中的表达

本组所有病例的骨髓组织中均可见M2型巨噬细胞浸润，在骨髓组织中均可见细胞膜或/和细胞浆着色的CD163+的M2型巨噬细胞浸润。对照组骨髓中可见巨噬细胞稀疏散在浸润，数量少，见图1。

2.2 CD163+在各组中的表达

CD163+在对照组、CML-CP组、CML-AP组、CML-BP组、缓解组、未缓解组中均有不同程度的浸润。经统计学分析，CD163+CML各期中的表达明显高于对照组（t=17.20、34.54、57.26、6.01、11.27、57.40，P<0.05），CML-BP组患者表达高于CML-AP组，CML-AP组明显高于CML-CP组（t=22.50，17.71，P<0.05），缓解组明显高于对照组（t=46.12，P<0.05），未缓解组与CML-BP相比有增高趋势，但差异无统计学意义（t=0.19，P>0.05），见表1。

2.3 CD34+CD38-CD123+在各组中的表达

CD34+CD38-CD123+在对照组、CML-CP组、CML-AP组、CML-BP组、缓解组和未缓解组中均有不同程度表达，见图2。经统计学分析，CML-CP明显高于对照组（t=21.45，P<0.05），随着病情进展，CD34+CD38-CD123+细胞表达逐渐增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP，且组间比较差异有统计学意义（t=20.46，20.54，P<0.05）。患者经治疗完全缓解后，CD34+CD38-CD123+细胞表达有所降低，但仍高于对照组（t=2.86，P<0.05）；未缓解组CD34+CD38-CD123+细胞有增高趋势，但与CML-BP组相比无统计学意义（t=0.57，P>0.05），见表1。

2.4 CD163+巨噬细胞浸润密度与LSC相关性

在CML-CP、CML-AP、CML-BP、缓解组、未缓解组中，LSC与CD163+巨噬细胞浸润密度间呈显著的正相关关系（r=0.863、0.938、0.905、0.916、0.914，P<0.01）。

3 讨论

巨噬细胞是一类广泛分布于体内动态的、非均质的、具有迁移性的细胞群体，是机体免疫系统的重要组成部分；在不同微环境作用下，巨噬细胞可极化为具有不同分子特征和功能特征的亚群，即M1型或M2型，对肿瘤发生、发展起着截然相反的作用[6-7]。M1型巨噬细胞具有抗原提呈和吞噬肿瘤细胞等细胞毒性效应，而M2型巨噬细胞可通过自分泌、旁分泌途径参与肿瘤细胞的恶性增殖、抵抗凋亡及侵袭和转移，又被称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）。已有研究表明CD163+是识别M2型巨噬细胞的标志物[8]。

LSC是指存在于白血病患者体内的一群极微量的细胞，这些微量的细胞通常处于相对静止的非增殖状态（G0期）。但因其具有强大的自我更新和分化能力，对白血病的发生、发展、不能被治愈及易复发起至关重要的作用[2]。对于LSC的标志研究已证明，CD123是目前公认的可以从正常造血干细胞（HSC）中识别LSC的一个標记，即CD34+CD38-CD123+仅表达于LSC的表面而HSC不表达[9-10]。本研究应用CD34+CD38-CD123+作为慢性粒细胞白血病患者LSC的标记，检测CML不同时期LSC的表达情况。

已有研究表明，在慢性粒细胞白血病患者骨髓微环境中均有M2型巨噬细胞的浸润，其在数量和功能上均占据优势，且随着疾病的进展阳性细胞数逐渐增高[11]。本文通过对CML患者不同时期骨髓巨噬细胞及LSC的研究发现，在CML各组患者骨髓组织中CD163+均高表达，且随着疾病的进展阳性细胞数逐渐增高。LSC在对照组中几乎检测不到，而在CML各组中均检测到有LSC的存在，而且随着病情的进展逐渐增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP>对照组。通过对CD163+与LSC的相关性分析发现，随着M2型巨噬细胞浸润密度的不同，LSC也发生相应的变化；M2型巨噬细胞浸润密度越高，LSC表达越高，即M2型巨噬细胞浸润密度与LSC的阳性细胞数呈正相关。提示CML患者骨髓微环境中M2型巨噬细胞的增多，可能是LSC为逃避巨噬细胞的杀伤作用，分泌大量细胞因子如CCL2、VEGF、TGF-β等，将外周血单核细胞大量招募进入骨髓后分化为巨噬细胞，并“迫使”巨噬细胞活化表型及功能朝着有利于LSC发展的M2型转化，从而进一步增强了LSC的恶性生物学行；而M2型巨噬细胞本身也能分泌大量的CCL2、IL-10、TGF-β和VEGF，通过正向反馈进一步促进巨噬细胞的招募与极化[12-13]；M2型巨噬细胞通过自分泌、旁分泌途径参与LSC的恶性增殖、抵抗凋亡及侵袭，导致CML的发生、发展。但鉴于CML发病的多因素性和巨噬细胞及LSC调节机制的复杂性，对于CML患者骨髓中的巨噬细胞是来源于外周血、其他组织还是骨髓源性的或几者兼有及对LSC的调控机制还有待进一步研究。结果还显示，CML经治疗完全缓解后CD163+及LSC表达水平较有所降低，但仍高于对照组，说明CML经治疗后虽达到了形态学及基因水平的缓解，骨髓微环境仍未恢复正常，还存在复发的因素。所以在CML缓解后，如何恢复患者机体乃至骨髓微环境的平衡，可能是最终清除白血病微小残留的途径之一。例如，如何阻止CML患者骨髓微环境中巨噬细胞的招募、如何阻止巨噬细胞被极化为M2型，或者如何将M2型巨噬细胞逆转为M1型等都是今后值得研究的课题。

总之，在CML患者骨髓微环境中巨噬细胞的大量浸润且被极化为M2型，M2型巨噬细胞与LSC数具有明显的正相关关系，说明M2型巨噬细胞在CML患者骨髓中可以促进LSC的增殖、分化；有望为CML的发生，发展机制、治疗及预后判断提供新的思路和理论依据。

参考文献

[1] Cortez-Retamozo V，Etzrodt M，Newton A，et al.Angiotensin II drives the production of tumor-promoting macrophages[J].Immunity，2013，38（2）：296-308.

[2] Goldman J，Gordon M.Why do chronic myelogenous leukemia stem cells survive allogeneic stem cell transplantation or imatinib：does it really matter[J].Leukemia Lymphoma，2006，47：1-7.

[3]张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第2版.北京：科学出版社，1997：134-136.

[4] Kim D W，Min H S，Lee K H，et al.High tumour islet macrophage infiltration correlates with improved patient survival but not with EGFR mutations，gene copy number or protein expression in resected non-small cell lung cancer[J].Br J Cancer，2008，98（6）：1118-1124.

[5]朱海波，赵明峰，谢芳，等.白血病干/祖细胞相关基因表达在急性白血病中的临床意义[J].中国实验血液学杂，2011，19（5）：1150-1155.

[6] Sica A，Mantovani A.Macrophage plasticity and polarization：in vivo veritas[J].J Clin Invest，2012，122（3）：787-795.

[7] Biswas S K，Mantovani A.Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subset： cancer as a paradigm[J].Nat Immunology，2010，11（10）：889-896.

[8] Shabo I，Svanvik J.Experssion of macrophage antigens by tumor cells[J].Adv Exp Med Biol，2011，714：141-150.

[9] Hauswirth A W S，Florian D，Printz，et al.Expression of the target receptor CD33 in CD34+/CD38-/CD123+AML stem cell[J].Eur J Clin Invest，2007，37（1）：73-82.

[10] Misaghian N，Ligresti G，Steelman L S，et al.Targeting the leukemic stem cell：the Holy Grail of leukemia therapy[J].Leukemia，2009，23：25-42.

[11] Jian-Xin S，Zi-Jin D，Yan W，et al.Assessment of the Number and Phenotype of Macrophages in the Human BMB Samples of CML[J].Bio Med Research International，2016，2016：8086398.

[12] Chen L，Yuan W，Chen Z，Wu S，et al.Vasoactive intestinal peptide represses activation of tumor-associated macrophages in gastric cancer via regulation of TNFα，IL-6，IL-12 and iNOS[J].Int J Oncol，2015，47（4）：1361-1370.

[13]趙阳，赵勇.单核-巨噬细胞起源及发育分化的特征与分子调控[J].中国免疫学杂志，2014，30（1）：126-132.

（收稿日期：2017-07-31）