王立刚

摘 要：目的：鉴定苹果树腐烂病拮抗细菌，测定其抑菌作用。方法：研究所周围四个县内20个苹果园中的110份苹果树腐烂病病皮，进行接抗菌鉴定，通过培养、染色方法，观察接抗菌的性状，提取DNA，鉴定。将获得的拮抗剂制作稀释液，接种到苹果樹腐烂病菌饼周围，进行抑菌率分析。结果：共检出了3种抑菌率尚可的细菌，编号AC-1、AC-5、DF-3，分别来源于枝条、枝条、土壤。AC-1、AC-5、DF-3三种接抗菌随着倍数的上升，对苹果树腐烂病菌的抑制率呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。显微镜下分析，抑制试验后的苹果树腐烂病菌出现更多的内含物溢出、菌丝断裂、畸形，浸染力下降。结论：就近采样进行鉴定，可获得苹果树腐烂病拮抗细菌，稀释液仍然有较好的抑菌作用，但会明显下降。

关键词：苹果树腐烂病；拮抗；抑菌作用

苹果是一种常见的水果，我国是世界苹果生产大国。苹果树腐烂病是威胁苹果产业的常见疾病，是一种真菌病害，患病果树几乎丧失结果能力，常有80%的果树需要锯掉果枝或树干，造成果园丧失生产经济价值。苹果树腐烂病治疗方法较多，其中生防法为主要方法，发展潜力较大。本次研究尝试鉴定苹果树腐烂病拮抗细菌鉴定，评价其抑菌能力。

一、材料与方法

1.实验材料

研究所周围四个县内20个苹果园中的110份苹果树腐烂病病皮。

2.仪器与试剂

营养琼脂培养基（NA）、营养肉汤（NA）培养基，摇床，各种浓度的乙醇，显微镜，染色液、助染剂的供试染液，电泳仪、电热恒温水槽，凝胶成像系统，紫外可见分光光度计等。

3.方法

（1） 拮抗菌鉴定。首先：获得菌株，常规组织块分裂方法，直接从病变树皮的边缘分离，获得完整、无污染的病变树皮。75%乙醇表面消毒，挑取真菌实体，种植在PDA培养基上，25%孵育箱中培养，获得菌落、单孢分离株，4℃备用。其次，进行致病性验证以及形态学观察，采用显微镜下对比实验室致病性验证、果园采集的病变树皮及你想对比，鉴定实体的大小、形态特征。再次，进行拮抗菌的分离、筛选，取风干过筛的土壤10g，加入90ml，无菌水，28℃、180r/min，震荡2h，挂取获得苹果树腐烂病真菌，进行接种鉴定，28℃培养24h。再次，进行接抗菌的筛选，采用平板对峙法进行筛选，花卉采用游标卡尺测量病原菌的直径，计算抑菌率，筛选接抗菌。进行接抗菌的鉴定，通过培养、染色方法，观察接抗菌的性状，提取DNA。

（2） 抑菌分析。将获得的接抗菌，进行抑制作用。将活化好的细菌（A、B、C种），接种在NB培养基28℃，180r/min，培养48h，高速离心10000r/min，30min，取上清液，细菌过滤器上过滤，涂布在NA培养基，无菌下封装，无菌发酵，获得原液，进行稀释，制备稀释液。采用玻片法进行孢子萌发试验，进行抑菌率分析（抑制率=[（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率）]×100。将苹果腐烂病菌采用PDA培养基培养72h，转接到另外一个培养基。分别将三种拮抗剂无菌发酵液接种在病原菌对称的四个方向，距离2cm左右，浓度为原液、200、400倍，制作药剂对照，以无菌水作为空白对照，25℃培养箱按培养，测量菌落直径，计算抑菌率。最后，将接抗菌无菌发酵液稀释200备，接种在PDA培养基，25℃培养箱暗培养，1周后从病菌菌落边缘挑取少量的菌丝，显微镜下观察形态、颜色改变情况。

4.统计学处理

采用SPSS20.0软件进行数学分析，抑制率服从正态分布，采用（Mean±SD）（ ±s）表示，两两比较采用t检验，三组间比较采用F检验，显微镜检查情况采用描述性分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

二、 结果

1.鉴定结果

共检出了3种抑菌率尚可的细菌，编号AC-1、AC-5、DF-3，分别来源于枝条、枝条、土壤，抑菌率分别为（68.4±5.6）%、（67.5±8.1）%、（58.0±9.4）%。检出了44种细菌，3种抑菌率≥50%，抑菌率在0%～69之间。

2.抑菌结果分析

AC-1、AC-5、DF-3三种接抗菌随着倍数的上升，对苹果树腐烂病菌的抑制率呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。显微镜下分析，抑制试验后的苹果树腐烂病菌出现更多的内含物溢出、菌丝断裂、畸形，浸染力下降。

三、讨论

苹果树腐烂病拮抗细菌有潜力作为疾病的治疗，从周围环境包括枝条、土壤，最有可能获得接抗菌。本次研究显示，从土壤、枝条获得44种细菌，3种抑菌率≥50%，抑菌率在0%～69之间。鉴定及其抑菌作用效果存在一定的差异，在55～69之间。需要注意的是，随着三种接抗菌倍数的上升，其仍然有明显的拮抗作用。镜下检查发现，抑制试验后的苹果树腐烂病菌出现更多的内含物溢出、菌丝断裂、畸形，浸染力下降，接抗菌可能会通过削弱病原菌的侵染能力、杀灭病原菌发挥拮抗作用。

参考文献：

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