张 强 刘 一 吴晓敏 束良佐 宋运贤 陈 楚 龙民慧*

(1.淮北师范大学生命科学学院/信息学院，淮北 235000； 2.资源植物生物学安徽省重点实验室，淮北 235000)

三叶青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)是我国特有的葡萄科(Vitaceae)崖爬藤属(Tetrastigma)珍稀药用植物。现代医学研究证实，它具有抗炎、镇痛与解热、抗病毒、保肝等作用[1～5]。临床上以地下块根或全草入药，广泛用于抗癌、抗肿瘤及抗艾滋病毒等疾病[6～8]。三叶青的提取物中含有多种药用活性成分。目前已经鉴定出的化学成分有黄酮、黄酮苷、淀粉、还原糖、甾类化合物、油脂以及氨基酸等多种成分[9～11]。其中重要的生理活性物质有黄酮类和黄酮苷类，如原花青素B1、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、异槲皮苷和山柰酚等[12]。

氮素作为植物最重要的营养元素之一，对植物的生长发育起着非常重要的作用，是叶绿素的主要成分之一，也是蛋白质、核酸等重要生命物质的构成元素，同时亦可以影响植物次生代谢物质的积累。已有研究证实氮素可直接或间接地影响植物体内黄酮类化合物等次生代谢产物的合成，并且还发现不同形态氮肥对黄酮类化合物的合成影响差异显著[13～16]。黄酮类化合物的合成途径主要通过苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸4-羟基化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)等酶催化下将苯丙氨酸催化成4-香豆酰CoA(4-coumaroyl-CoA)[17]。然后，丙二酰CoA和对香豆酰-CoA在查尔酮合成酶(CHS)的催化下反应生成第一个具有C15基本骨架的黄酮类化合物-查尔酮，合成查尔酮之后，它再进一步转化和生成各种黄酮类化合物[18]。PAL酶催化苯丙氨酸生成肉桂酸和香豆酸等物质，是连接苯丙烷化合物和初级代谢的关键酶，对于调节黄酮类化合物合成具有重要的作用，同时CHS酶是催化形成黄酮基本骨架的主要催化酶。氮元素能够通过PAL和CHS来对植物黄酮类化合物的合成进行影响，但不同植物种类和不同的氮形态影响均不一致。然而，氮素及其不同形态是否通过PAL和CHS影响植物体内黄酮类化合物的生物合成及相关机制目前还鲜见报道。因此，了解氮素对三叶青生长及黄酮类化合物生物合成的影响有利于三叶青的栽培和推广，从而进一步有效提高三叶青的利用价值。

本研究通过盆栽控制试验，比较研究不同形态氮肥对三叶青黄酮类化合物的积累以及氮同化的影响，并研究不同氮形态对黄酮类化合物累积关键酶的表达调控，以期为三叶青进一步的开发和利用提供科学依据，并对推动三叶青的应用推广具有重要意义。

1 材料方法

1.1 供试材料

盆栽试验于2015年3月～2016年8月在安徽省淮北市郊区试验基地(租赁)内进行，供试三叶青植株由浙江省磐安县紫腾三叶青专业合作社提供。供试土壤为壤土，取自淮北农田，采样深度为表层20 cm，土壤pH值为7.2，W(有机质)为2.62%，W(总氮)为1.35 g·kg-1，W(总磷)为0.72 g·kg-1，W(碱解氮)为76.84 mg·kg-1，W(速效磷)为36.86 mg·kg-1，W(速效钾)为73.76 mg·kg-1，阳离子交换量为6.54 cmol·kg-1，该土壤与草木灰按照4∶1的比例混合均匀装盆。氮肥为铵态氮肥[(NH4)2SO4]和硝态氮肥[NaNO3]，不含结晶水，均为分析纯；反转录试剂盒和QPCR mix试剂盒购自Thermo Fisher公司(美国)，PAL和CHS活性检测试剂盒购自北京致力生科科技有限公司(中国)。PAL elisa检测试剂盒购自江莱生物科技有限公司(中国)、CHS抗体购自Agrisera公司(瑞典)，其余化学试剂均购自Sigma公司(美国)。

1.2 三叶青的处理

1.3 PAL特异性抑制剂(AOA)处理

使用PAL特异性抑制剂(AOA)浓度为200 Umol·L-1的水50 mL浇入铵态氮和硝态氮处理后的三叶青根部，每3天1次，共10次，与铵态氮处理和硝态氮处理作为对照(CK)。

1.4 样品处理与黄酮类成分含量测定

将新鲜的植物样品用自来水清洗后再用去离子水清洗干净，然后将三叶青植株分为茎、叶和主根3个部位。每个处理取6株三叶青样品在105℃杀青30 min，然后70℃烘干至恒重，待冷却后磨碎待用。测定叶和主根部位的原花青素B1、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、异槲皮苷和山柰酚等黄酮类化合物的含量。精密称取原花青素B1、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰酚，加甲醇分别制成每1 mL含0.5 mg的原花青素B1、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰酚甲醇溶液；取样品粉末0.5 g，加入甲醇50 mL，称量，放置过夜，置于80℃水浴，放至室温，再称量，用甲醇补足，摇匀，过滤，取滤液供试。分别精密吸取对照品溶液与待测样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定。

1.5 PAL和CHS提取与活性测定

称取新鲜植物样品1.0 g，加入2 mL 100 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH7.5)、2 mL 250 mmol·L-1蔗糖、2 mL 4 mmol·L-1氯化镁和2 mL 5 mmol·L-1巯基乙醇，冰浴磨成组织匀浆液(10%)。10 000 r·min-1离心10 min，取上清液为酶粗提液。采用PAL和CHS酶试剂盒进行测试，酶标仪测定酶活性。PAL和CHS酶活性的单位用U·g-1表示。

1.6 QPCR检测CHS和PLA的转录

采用QIAGEN的植物RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit提取三叶青根部和叶片的总RNA，用微量紫外分光光度计(Merinton,美国)对RNA的浓度及纯度进行检测。利用Thermo公司提供的cDNA试剂盒将总RNA反转录成单链cDNA，并将质量浓度统一稀释至50 ng·mL-1。PAL、CHS基因(无相关序列信息)引物参照葡萄科葡萄的引物序列，以葡萄科葡萄的基因GHPDH为内参，引物序列如表1所示，委托北京致力生科科技有限公司合成。荧光定量PCR使用Life technologies的QPCR mix体系在Life 7500 QPCR仪上进行。50 μL的体系，上下游引物各1 μL，QPCR mix 25 μL，cDNA为2 μL，用去离子水补足到50 μL。PCR的条件如下：95摄氏度预变性10 min，95摄氏度变性45秒，54摄氏度退火30秒，72摄氏度延生1分钟，总共40个循环。

表1 引物序列信息

1.7 ELISA和WB分别检测PLA、CHS的表达情况

植物蛋白的制备依据北京致力生科科技有限公司植物蛋白提取试剂盒进行，PLA表达量检测根据江莱生物PLA检测试剂盒说明书进行，所有检测重复3次，数值读取运用美国AWARENESS酶标仪进行。将制备好的蛋白在12%的SDS-PAGE进行分离(仪器为美国伯乐公司电泳设备)，利用伯乐半干转移设备将蛋白转移到PVDF膜上(Roche)。PVDF膜用5%脱脂奶粉的TBST中在4℃冰箱进行封闭12 h。TBST将封闭好的PVDF膜洗涤3次，每次5 min。用5%脱脂奶粉稀释一抗CHS，一抗的稀释比例为(1∶1 000)，PVDF膜与稀释后的一抗在常温下进行孵育2 h，然后TBST洗涤膜3次，每次5 min；然后用辣根标记的山羊抗兔二抗(1∶100在5%脱脂奶粉的TBST，购自北京致力生科科技有限公司)进行杂交，TBST洗涤3次，每次5 min。然后在柯达胶片上进行曝光，发光液等购自Thermo公司。

1.8 数据处理

所有试验数据的统计、分析和作图均采用SPSS 23.0(SPSS,Chicago,IL)和SigmaPlot 12.5(Systat Software,San Jose,CA,USA)软件完成。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 高效液相色谱测定三叶青黄酮类活性成分标准曲线的绘制

根据1.4节的测定结果，使用高效液相色谱测定结果绘制标准曲线。如图1所示，求得原花青素B1、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、异槲皮苷和山柰酚的回归方程分别为Y=5.401 2X，R2=0.999 2；Y=3.094 5X，R2=0.999 8；Y=12.247 0X，R2=1.000 0；Y=4.711 8X，R2=1.000 0；Y=10.532 0X，R2=0.999 3和Y=1.741 2X，R2=0.997 1，说明具有良好的线性关系，因此原花青素B1、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、异槲皮苷和山柰酚质量浓度在上述横坐标数值范围内，就可以根据这些方程进行定量分析。

2.2 不同氮形态对三叶青中黄酮类累积的影响

图2 不同形态氮素处理对三叶青根和叶中黄酮类化合物含量的影响 *，**分别代表不同处理之间差异达到显著(P<0.05)和极显著水平(P<0.01) 下同。Fig.2 Effects of different nitrogen forms on the flavonoids contents in the roots and leaves of T.hemsleyanum * and ** indicate the difference at significant (P<0.05) or extremely significant(P<0.01) level between treatments,respectively.The same as below.

图4 不同氮素形态处理对三叶青根和叶中的PAL和CHS基因表达量的影响Fig.4 Effects of different nitrogen forms on the expression level of PAL and CHS genes in the roots and leaves of T.hemsleyanum

2.3 不同氮形态对三叶青根中PAL和CHS转录的影响

2.4 不同氮形态对三叶青PAL和CHS表达量的影响

图5 不同氮素形态处理对三叶青根和叶中的PAL和CHS酶活性的影响Fig.5 Effects of different nitrogen forms on the activities of PAL and CHS enzymes in the roots and leaves of T.hemsleyanum

2.5 不同氮形态对三叶青PAL和CHS酶活性的影响

2.6 AOA对不同氮形态处理三叶青PAL和CHS活性及黄酮类化合物积累的影响

表2AOA抑制剂对不同氮形态处理三叶青中PAL和CHS活性的影响

Table2EffectsofPAL-specificinhibitor(AOA)ontheenzymeactivitiesofPALandCHSinT.hemsleyanumunderdifferentnitrogenformssupply

铵态氮Ammonium-N supply硝态氮Nitrate-N supplyPAL特异性抑制剂AOA—PAL特异性抑制剂AOA—PAL酶活性PAL enzyme activity2.99±0.1921.01±2.36∗∗4.09±0.2339.12±4.75∗∗CHS酶活性CHS enzyme activity21.91±0.9920.05±3.8912.51±5.0125.51±5.33∗∗

注：*，**分别代表与AOA处理组相比差异达到显著(P<0.05)和极显著水平(P<0.01)，下同。

Note： * and ** indicate the difference is significant(P<0.05) and very significant(P<0.01) as compared with AOA-treated group,respectively,the same as below.

表3AOA抑制剂对不同氮形态处理三叶青中黄酮类成分含量的影响

Table3EffectsofPAL-specificinhibitor(AOA)ontheaccumulationofflavonoidssubstancesofT.hemsleyanumunderdifferentnitrogenformssupply

铵态氮Ammonium-N supply硝态氮Nitrate-N supplyPAL特异性抑制剂AOA—PAL特异性抑制剂AOA—原花青素B1Procyanidin B143.54±2.88117.56±4.94∗∗50.11±9.54220.01±11.12∗∗芦丁Rutin34.57±1.61103.21±4.09∗∗52.45±5.01338.61±18.95∗∗山柰酚-3-O-芸香糖苷Kaempferol-3-O-rutinoside43.65±1.56326.15±51.12∗∗89.54± 9.05532.83±26.78∗∗槲皮素Quercetin28.91±6.34126. 09±7.77∗∗40.08±9.91188.27±12.33∗∗异槲皮苷Isoquercitrin3.28±0.8519.33±1.01∗∗8.77±0.8226.28±7.03∗∗山柰酚Kaempferol6.79±0.9017.19±1.03∗∗8.03±0.8642.91±1.81∗∗

3 讨论

三叶青是抗肿瘤常用药物，也具有抗炎、解热、护肝等作用[1～8]。现代药理研究结果表明总黄酮、总氨基酸和多糖为三叶青中主要活性物质[9～11]，尤其是黄酮类物质是其药效的主要成分。因此，提高中药材三叶青体内黄酮类物质的生物合成是三叶青是三叶青开发和研究的热点之一。

图6 AOA抑制剂对不同氮形态处理三叶青叶片PAL和CHS活性及黄酮类化合物积累的影响Fig.6 Effects of PAL-specific inhibitor(AOA) on the enzyme activity of PAL and CHS,and flavonoids accumulation in the leaves of T.hemsleyanum under different nitrogen forms supply

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