■ 王贺 （惠州市海洋技术中心，广东 惠州 516001）

李庆勇（惠州市渔业研究推广中心，广东 惠州 516001）

惠州是水产养殖大市，全市水产养殖面积51万亩，其中海水养殖12万亩，淡水养殖39万亩，罗非鱼是目前惠州最主要的淡水鱼类养殖品种。近年来，惠州罗非鱼细菌性疾病多次爆发，导致大量罗非鱼死亡，严重影响了惠州罗非鱼产业乃至整个水产养殖业，十分有必要对罗非鱼细菌性疾病的病原进行分子生物学鉴定并开展药敏试验，弄清惠州地区罗非鱼细菌性疾病的致病原和敏感药物，为罗非鱼细菌性疾病的治疗提供参考。与传统的细菌鉴定相比，细菌的分子生物学鉴定具有快速、准确以及成本低等特点，且已经建立了完善的鉴定方法步骤，对市级水产养殖技术人员比较适用。

1 材料与方法

1.1试验材料

试验菌株为2014-2017年在惠州辖区内患病罗非鱼体内采集保存的菌株，共172株。脑心浸液培养基、血平板等微生物培养试剂耗材全部购自广东环凯生物科技有限公司；药敏片为英国产OXOID品牌；分子鉴定试剂耗材购自大连宝生生物有限公司（TaKaRa）。

1.2 病原鉴定

革兰氏染色初步判断。按照DNA提取试剂盒说明书的方法提取细菌DNA作为模板，以1492r/F27为引物，进行PCR扩增（扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min）。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定条带后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，测序结果在GenBank上进行序列比对，进行16S rRNA的分子鉴定。

1.3 药敏分析

根据已报道的文献选取常用药物纸片20种（表1）。挑取单克隆菌落接种至BHI液体培养基中，28℃摇床培养过夜培养，使用BioPhotometer plus测定菌液OD600数值，空白对照为同批次的灭菌BHI液体培养基。根据测得的OD600数值计算菌液浓度，然后使用无菌的BHI液体培养基调整菌液浓度至1.5×108CFU/ml，移液器吸取调整后的菌液200µL于固体BHI平板，使用灭菌后的L型玻璃棒均匀涂布。待菌液稍晾干之后，使用镊子贴上药敏纸片，每个平板放置5～6种药敏纸片，每一株分离菌株设置两个平行实验组，置于恒温生化培养箱中，28℃培养24h。然后用电子游标卡尺，测定抑菌圈大小，参照药敏纸片产品说明书对菌株的药物敏感性进行判定（表1）。

2 结果

2.1 鉴定结果

表1 药敏纸片种类及判定标准

鉴定的172株菌株中，革兰氏阳性菌（G+）153株，占89%；革兰氏阴性菌（G-）19株，占11%。PCR结果显示，扩增的片段在1,500bp处有明显条带（图1）；经测序并在GenBank上比对发现，无乳链球菌153株，嗜水气单胞菌8株，迟缓爱德华氏菌3株，维氏气单胞菌6株，类志贺邻单胞菌2株。

2.2药敏分析结果

药敏分析结果显示，菌种对不同药物的敏感性不同（图2），其中无乳链球菌主要对卡那霉素、庆大霉素、磺胺复合物、链霉素等耐药，对氧氟沙星、四环素等敏感（见表2）。嗜水气单胞菌主要对庆大霉素、磺胺复合物、四环素等耐药，对恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考等敏感；维氏气单胞菌对林可霉素、青霉素G、庆大霉素及氯霉素耐药，对氧氟沙星、诺氟沙星、氟苯尼考等敏感；迟缓爱德华氏菌对磺胺复合物、四环素等耐药，对恩诺沙星、氧氟沙星等敏感。

3 讨论

2014～2017年采集保存的172株罗非鱼致病菌中，无乳链球菌数量为153株，占总数的89%，说明近年来导致惠州罗非鱼发生细菌性病的致病原主要为无乳链球菌，其他致病菌相对出现较少。但在采样的过程中也发现，症状相似的患病罗非鱼上分离到的致病菌并不属于同一种菌。如眼球突出通常作为判断罗非鱼链球菌病的主要症状，但是在眼球突出的患病罗非鱼体内也分离到过单一的迟缓爱德华氏菌。因此，在日常的技术服务过程中，单靠经验或突出症状判断罗非鱼病因已经不太准确。利用现代分子生物学手段进行病原鉴定是较为准确快捷的一种方法。

表2 罗非鱼源无乳链球菌分离菌株（153株）对20种药物的药敏试验结果

图1 部分菌株16S rRNA 扩增结果电

图2 细菌药敏试验

在渔业生产实际活动中，养殖的水产动物一旦发病，养殖户最迫切的需要是用药指导，以减少养殖损失，因此，快速、简便、科学、合理的用药指导方法就显得尤为重要。目前，药敏分析是较为准确简便的方法。在实际操作中，为尽快给予准确的用药指导方案，可不用进行病原鉴定而直接进行药敏分析，根据药敏实验结果为养殖户提供快速的用药指导意见，能大大缩短时间，最大限度减少养殖户损失。