黎翊君，戴俊东，王渐鸿，余家齐，王 杰，茅玉炜

（北京中医药大学中药学院 北京 102488）

目前，已有大量文献报道丹参水溶性成分丹参总酚酸除了对多种心血管疾病具有治疗作用外，丹参总酚酸还能通过抗氧化应激损伤、抑制血小板聚集和抗炎症损伤等途径，对急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病发挥着治疗和保护作用[1-5]。目前有关丹参总酚酸的研究多采用口服或注射的给药方式，体内研究表明丹参总酚酸口服生物利用度低[6]；而静脉滴注虽能使药物直接进入血液循环而直接发挥治疗作用，治疗效果较好。但对于一些慢性肺部疾病，其需长期用药，导致患者依从性较差。肺部吸入给药作为一种非注射途径的给药方式，患者依从性较好。同时可靶向递送药物至肺部，降低给药剂量和毒副反应。加上肺部较大的吸收表面和丰富的血管分布，药物在肺部能快速地被吸收而直接进入血液循环，可避免肝脏首过效应，提高生物利用度，在预防和治疗呼吸系统疾病方面优势显著[7]。

行星式球磨机多用于药物的微粉化及混合，可实现微米甚至纳米级别的超微粉碎[8]，其具有药物用量少，产率高、成本低、操作简便等优势，在科研研究中应用广泛。课题组前期实验表明采用共研磨法制备丹酚酸-丹参酮微粉的球磨工艺对药物的结晶态影响较小[9]，但是经过微粉化的药物粒子具有较高的表面自由能，粒子间静电吸附作用明显，易产生粒子团聚的现象。卵磷脂是一种生物相容性好、易吸收的机体内源性物质，用其包合水溶性药物粒子，对粒子表面进行修饰，可改善由于静电吸附和药物吸湿性造成的粒子团聚现象。精氨酸是《中国药典》2015年版（二部）收载的常用氨基酸类药，L-精氨酸为人体内源性碱性氨基酸，在一些市售的冻干粉针和注射剂中，L-精氨酸常用作稳定剂和pH调节剂[10]，作为“分散性增强剂”用于降低粉末的表面自由能[11]，同时对肺部炎症具有一定的干预和保护作用[12]。

本实验拟沿用课题组前期筛选出的球磨制备工艺[9]，湿法球磨制备得到丹参总酚酸药物微粉并对其进行粉体学性质评价，对比卵磷脂的加入及加入比例、精氨酸的加入对丹参总酚酸药物微粉粉体学性质的影响，筛选出粉体学性质较优的药物微粉，为后续干粉吸入剂的制备提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 试药和仪器

丹参总酚酸原料（南通飞宇生物科技有限公司，总酚酸含量80%，丹酚酸B含量不低于60%）；L-精氨酸（北京酷来搏科技有限公司，纯度≥98%），卵磷脂（上海麦克林生化科技有限公司，纯度＞90%），硫酸铵，无水CaCl2，正庚烷均为分析纯。

变频行星式球磨机（XQM-0.4 L，南京大冉科技有限公司）；不锈钢球磨罐（100 mL，南京大冉科技有限公司）；冷冻干燥机（LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司）；SUPRA 55场发射扫描电镜；激光粒度分布仪(BT-2001，丹东百特仪器有限公司)；真空干燥箱(DZF-6050，上海博迅实业有限公司)；LC-20A高效液相色谱系统（SPD-20A检测器，日本岛津公司）；Kromasil C18色谱柱（4.6×250 mm,5 μm，北京迪马科技有限公司）；CPA225D电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；Twister（苏州万通定量阀系统有限公司）；新一代药用撞击器(Copley Scientific公司)。

1.2 丹参总酚酸微粉的制备

取丹参总酚酸原料100 g，加水溶解过滤后得到丹参总酚酸溶液，用50 mg⋅mL-1L-精氨酸调节pH为5.0左右，分别冻干得到丹酚酸（不调pH值）、丹酚酸-精氨酸2种冻干粉。每种冻干粉分别加入0.5%、1%和2%的卵磷脂，沿用课题组前期制备工艺，选择正庚烷为分散剂，浆料浓度为50%（g⋅g-1），研磨介质为Φ3和Φ5不锈钢磨球（数量比8∶1），球料比17.5，研磨转速为250 r⋅min-1，球磨3.5 h后将球磨罐内的浆料直接转移至扁形称量瓶中，30℃减压干燥24 h后，从扁形称量瓶中转移出药物过150目筛，即得6种药物微粉分别为丹酚酸-0.5%卵磷脂（Sal-0.5%）、丹酚酸-1%卵磷脂（Sal-1%）、丹酚酸-2%卵磷脂（Sal-2%）、丹酚酸-精氨酸-0.5%卵磷脂（Sal-Arg-0.5%）、丹酚酸-精氨酸-1%卵磷脂（Sal-Arg-1%）、丹酚酸-精氨酸-2%卵磷脂（Sal-Arg-2%）。

1.3 丹参总酚酸微粉的质量评价

1.3.1 微观形态

采用SUPRA55场发射扫描电镜对粉末的表观形态和聚集状态进行观察，分别取少量Sal原料、2种冻干粉和6种药物微粉均匀分布于导电胶布上，离子溅射仪上喷金30 min后，于扫描电子显微镜上观察，并采集图像。

1.3.2 粒径及其分布

采用丹东百特BT-2001激光粒度分布仪干法模式下测定Sal原料和6种药物微粉的粒径及其分布，分散介质为空气，样品为通用，气体压力范围为0.15-0.25 Mpa。

1.3.3 流动性

采用固定漏斗法测定Sal原料和6种药物微粉的休止角，每个样品平行测定3次。

1.3.4 引湿性

取一干燥器里面放置硫酸铵过饱和溶液，将干燥的扁形称量瓶置于干燥器中，24 h后精密称定重量。取Sal原料和药物微粉置于真空干燥箱（内置无水Ca-Cl2）中25℃脱湿24 h，平衡初始水分。取已平衡水分的Sal原料和药物微粉约0.5 g，平铺于扁形称量瓶中，精密称定重量，再置于上述干燥器中，分别于10 h和30 h后取出，盖好盖子，精密称定重量，计算Sal原料和6种药物微粉的吸湿増重，平行测定3次。

1.3.5 丹参总酚酸药物微粉体外沉积性质的测定

1.3.5.1 HPLC色谱条件与系统适应性

拟沿用前期实验已建立的丹酚酸B HPLC含量测定方法，色谱柱为Kromasil C18（5 μm，250×4.6 mm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（26∶74）；流速1.0 mL⋅min-1，检测波长286 nm，柱温30℃，进样量10 μL。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于6 000。

1.3.5.2 体外沉积率的测定

采用新一代药用撞击器（NGI）分别测定Sal-1%、Sal-2%、Sal-Arg-1%和Sal-Arg-2%4种丹参总酚酸药物微粉的体外沉积率，通常在20℃且相对湿度低于35%的条件下模拟药物微粉在肺部的沉积状况。首先打开NGI的铰链盖，按序将预分离器(pre-separator)、人工喉（induction port）和合适的入口适配器（mouthpiece adapter）同NGI上端入口处依次连接，S1-S7级收集杯内预涂硅油层预防粒子回弹。取装有药物微粉的3号HPMC胶囊一粒（14 mg）置于Twister给药装置内，转动旋钮碰开胶囊壳，在60 L⋅min-1的抽气流下抽吸4 s，检查P3/P2≤0.5，重复此过程完成10粒胶囊。用甲醇-水（8∶2）分别清洗给药装置、人工喉、预分离器、S1-S7级收集杯及微孔收集器（MOC）中的含药粉末，分别置于50 mL的棕色容量瓶中，甲醇-水（8∶2）稀释至刻度，摇匀，HPLC分别测定6种丹参总酚酸药物微粉各部分收集液中丹酚酸B的含量。

以欧洲药典为参考，在流速为60 L⋅min-1时，S1-S7级各收集盘中粒子的截断直径分别8.06、4.46、2.82、1.66、0.94、0.55和0.34 μm。本实验中定义10粒胶囊含药量的平均值为总药量（Total dose，TD），入口适配器、人工喉、预分离器、S1-S7级收集杯及MOC中的药量之和为药物微粉的递送剂量（delivered dose，DD），S2-S7级收集杯及MOC中的药量之和为微细粒子剂量（fine particle dose，FPD），即为空气动力学直径小于4.46 μm有效部位沉积量。计算4种丹参总酚酸药物微粉的DD、FPD和微细粒子百分比（fine particle percent，FPP），利用MMAD calculator计算质量中间空气动力学粒径(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和几何标准差(geometric standard deviation，GSD)。通常认为，GSD大小越接近1，药物微粉的粒度分布越窄。

2 结果与分析

2.1 微观形态

微观形态结果如图1-图9所示，由图可知，Sal原料和2种冻干粉成不规则片状，粒径较大，粒径跨度大；球磨后的药物微粉粒径明显减小，但一些细微粒子间仍存在轻微的聚集现象；加入1%和2%卵磷脂的微粉其粒径均匀性优于加入0.5%卵磷脂的微粉，粒子间的聚集现象也得到一定改善。

2.2 粒径及其分布

图1 Sal原料扫描电镜图

图2 Sal冻干粉扫描电镜图

图3 Sal-Arg冻干粉扫描电镜图

图4 Sal-0.5%微粉扫描电镜图

图5 Sal-1%微粉扫描电镜图

图6 Sal-2%微粉扫描电镜图

图7 Sal-Arg-0.5%微粉扫描电镜图

图8 Sal-Arg-1%微粉扫描电镜图

图9 Sal-Arg-2%微粉扫描电镜图

表1 粒径测定结果

粒径结果如表1所示，粒径分布如图10所示。根据《中国药典》2015版四部制剂通则-0111吸入制剂项的规定：吸入制剂中原料药物粒度大小通常应控制在10 μm以下，其中大多数应在5 μm以下。结果Sal原料粒径较大，粒径跨度范围大，10 μm以下粒子百分比仅有56.92%，不符合药典要求。球磨后的6种药物微粉的粒径均呈单峰分布，粒径均小于10 μm，符合药典要求，且5 μm以下粒子百分比均在85%以上。其中，Sal-Arg-1%、Sal-Arg-2%微粉粒径均小于5 μm，其粒径均小于Sal-1%、Sal-2%和Sal-Arg-0.5%微粉的粒径，说明精氨酸和卵磷脂的加入能有效改善丹参总酚酸药物微粉的粒径及其分布。

图10 Sal原料和6种药物微粉粒径分布图

表2 Sal原料和6种药物微粉的休止角（n=3）

2.3 流动性

Sal原料和6种药物微粉的休止角结果见表2。采用SAS统计学软件就卵磷脂的加入量对微粉流动性的影响进行单因素方差分析和多重比较，结果不同卵磷脂的加入量下药物微粉的休止角不全相等，差异具有统计学意义（p≤0.0001），且SNK-q检验结果表明Sal原料组（不加卵磷脂）、0.5%卵磷脂加入量组与1%卵磷脂加入量组间具有统计学差异，而1%卵磷脂加入量组与2%卵磷脂加入量组间无统计学差异，结果加入1%和2%卵磷脂的微粉组流动性最好，其次是加入0.5%卵磷脂的微粉组，原料药组的流动性最差，表明卵磷脂的加入可改善药物微粉的流动性。

2.4 引湿性

结果见表3。①采用SAS统计学软件就卵磷脂的加入量对10 h和30 h后微粉吸湿增重百分率的影响进行单因素方差分析和多重比较。结果10 h和30 h后不同卵磷脂加入量下药物微粉的吸湿增重不全相等，差异均具有统计学意义（p≤0.0001）。SNK-q检验结果在10 h和30 h后，Sal原料组（不加卵磷脂）、0.5%卵磷脂加入量组与1%、2%卵磷脂加入量组间均具有统计学差异，增重百分率大小均为Sal原料＞0.5%卵磷脂加入量组＞1%卵磷脂加入量组＞2%卵磷脂加入量组。②采用SAS统计学软件就精氨酸的加入对10 h和30 h后微粉吸湿增重百分率的影响进行单因素方差分析和多重比较。结果10 h和30 h后精氨酸组和不加精氨酸组药物微粉的吸湿增重不全相等，差异均具有统计学意义（p≤0.0001）。SNK-q检验结果在10 h和30 h后，精氨酸组和不加精氨酸微粉组间均具有统计学差异，增重百分率大小均为不加精氨酸组＞精氨酸组。③结果表明卵磷脂和精氨酸的加入均可改善药物微粉本身的吸湿性，且卵磷脂加入比例越大，相同条件下药物微粉的吸湿增重越小。其中，以Sal-Arg-2%药物微粉吸湿增重百分率最低。6种药物微粉吸湿增重百分率均较大，可能是球磨后药物粒子的粒径减小，粒子比表面积增大，吸湿性较强，故在制剂的制备和贮存过程中应严格控制环境湿度。

表3 Sal原料和6种药物微粉10 h和30 h后的増重百分率（n=3）

表4 4种丹参总酚酸药物微粉中丹酚酸B的体外沉积性质测定结果

图12 4种丹参总酚酸药物微粉中丹酚酸B在NGI各层级的沉积率

根据上述微观形态、粒径及其分布、流动性和引湿性结果，发现卵磷脂的加入量对药物微粉的粉体学性质影响较大，筛选出Sal-1%、Sal-2%、Sal-Arg-1%和Sal-Arg-2%4种丹参总酚酸药物微粉进行体外沉积性测定。

2.5 丹参总酚酸药物微粉体外沉积性质的测定

2.5.1 丹酚酸B的标准曲线

结果表面该方法专属性、仪器精密度、方法重复性和加样回收率均符合要求，丹酚酸B在0.0014-1.782 mg·mL-1范围内与其峰面积呈良好的线性关系，标准曲线见图11。

2.5.2 体外沉积率的测定

Sal-1%、Sal-2%、Sal-Arg-1%和Sal-Arg-2%4种丹参总酚酸药物微粉中丹酚酸B的体外沉积性质测定结果如表4所示，丹酚酸B在NGI各层级的沉积情况如图12所示。其中：①以Sal-Arg-2%的递送率和微细粒子百分比最高，分别为72.99%和14.07%，其递送率、微细粒子百分比、MMAD结果均优于Sal-Arg-1%，说明通过提高加入生理接受性良好的卵磷脂可一定程度上改善微粉的体外沉积性。②《中国药典》2015版通则0951规定：除另有规定外，微细药物粒子百分比应不少于每吸主药含量标示量的10%。其中只有Sal-Arg-1%、Sal-Arg-2%（13.74%和14.07%）符合药典规定，说明精氨酸对微粉的体外沉积性质具有改善作用。

3 讨论

结合上述质量评价结果，精氨酸和卵磷脂的加入对丹参总酚酸药物微粉粉体学性质具有一定的改善作用，且卵磷脂加入比例越大，粉体学性质越好，2%卵磷脂的加入量可以满足药典规定及生产要求。本实验筛选出Sal-Arg-2%药物微粉粉体学性质最好，其粒径小于5 μm，D50为1.153 μm，休止角为25.66°±1.24，在10 h和30 h后的吸湿增重为别为7.42%±0.05和11.02%±0.04，递送率为72.99%，微细粒子百分比为14.07%，MMAD为4.57 μm。故选择Sal-Arg-2%药物微粉为后续干粉吸入剂的制备提供物质基础。

正常大鼠离体肺组织匀浆的pH约为7.30-7.56[13]。但是正常情况下，由于肺部pH值受到血液pH值和CO2气体交换的影响，支气管和肺泡粘液的酸性大于血浆。本实验选择L-精氨酸调节丹参总酚酸pH值为5.0左右，是考虑到丹参总酚酸酸性较强，20 mg·mL-1的丹参总酚酸原料水溶液测得其pH值为2.4左右。国家食品药品监督管理局指出临床注射丹参多酚酸盐的pH值范围应为4-6。丹酚酸B水溶液稳定性较差，而粉末的稳定性良好[14]，丹参总酚酸的指标性成分丹酚酸B稳定的pH值范围为4-5，故兼顾安全性和丹酚酸B的稳定性，选择调节丹参总酚酸溶液pH值为5.0左右，用于制备适合肺部吸入的药物微粉。

由于经球磨后的药物粒子成不规则的多面体，粒子间具有较大的表面能，再加上药物本身具有较强的吸湿性，微粒间的静电吸附现象明显。NGI测定中，由于药物与胶囊壳、给药装置间的静电作用，大量药粉粘附在胶囊壳和吸入装置内壁上，难以随着气流进入撞击器；而微粒间的静电吸附使得小颗粒团聚导致粒径增大，多数团聚体在人工喉和预分离器部位发生沉降，造成药物在预分离器中的沉积率增大。静电吸附现象影响了4种微粉的递送率、微细粒子百分比FPP和GSD等结果，虽然卵磷脂的加入一定程度上能改善粒子间的团聚现象，但后期仍需加入载体改善粒子的流动性。

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