王宏燕，周晨阳，梁 乔，张 健，杨本勇，顾贵波★

（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳110164；2.辽宁省动物医学研究院，辽宁 沈阳110164）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（porcine respiratory disease complex，PMWS）最主要的病原[1]。PCV基因组为单链环状DNA分子，分为PCV1和PCV2两种血清型，PCV1低致病性或无致病性，基因组全长为1 753 bp，PCV2有致病性，能损伤猪的免疫系统，表现出多种病症，基因组全长为1 766～1 768 bp。目前PCV2基因组主要分为4个亚型（PCV2a～PCV2d）[2]，其中PCV2a、PCV2b在世界各地均有发现，PCV2c在丹麦有过记录[3]，PCV2d在中国、北美洲和南美洲有过报道[4]，PCV2d在中国的有些地区已有成为主要流行病毒株的趋势[5]。本试验通过临床病例获得1株PCV2d全基因组序列，通过比对PCV2的最新流行与变异信息，为有效防控PCV2建立前期基础。

1 材料与方法

1.1 病料采集及处理 病料来自辽宁省某市某猪场疑似PMWS病死仔猪的肺脏组织、淋巴结。将肺脏组织及淋巴结研磨后，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）按照1:5（病料:PBS）稀释混成匀浆，将匀浆吸入到EP管中，反复冻融3次，3 000 r/min离心20 min，取上清液于-70℃保存备用。

1.2 引物 根据Genebank公布的国内外PCV2参考毒株序列，合成1对特异性引物，PCV2-F：GTACCTTGTTGGAGAGCGGG，PCV2-R：TCACAGCAGTAGACAGGTCA，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 病料DNA的提取 用基因组DNA快速抽提试剂盒，按说明书上的操作方法提取组织病料DNA。

1.4 全基因组的扩增 以提取的组织病料DNA为模板进行PCR扩增，PCR采用50 μL反应体系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用灭菌超纯水补足50 μL。反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳结果。

1.5 产物回收、鉴定和测序 按照DNA凝胶回收试剂盒说明书，回收、纯化特异的DNA条带。……