于贵林，林杰，赵国华，艾福禄，王越

(辽宁省肿瘤医院，沈阳110042)

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸、不具有编码能力的核苷酸序列[1，2]。大量研究表明，lncRNA广泛参与肿瘤细胞的多种生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡等[3]；还可通过调节转录、调节各种转录后过程和招募染色质重组复合物等功能发挥作用[4]。识别癌相关的lncRNA并研究其分子和生物学作用具有重要意义。既往研究发现，胃癌细胞lncRNA lucat1过表达，其过表达与胃癌细胞侵袭和迁移能力呈正相关关系。有报道，甲酰肽受体2(FPR2)表达可影响上皮-间充质转化(EMT)而参与胃癌细胞的侵袭和转移[5]。前期我们采用生物信息学方法预测，lncRNA lucat1可能通过调节FPR2发挥作用。2017年3～8月，本研究对这一预测结果进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞SGC-7901、BGC-823及正常胃黏膜细胞GES-1取自辽宁省肿瘤医院中心实验室，置于含10% FBS的RPMI 1640培养基(Invitrogen公司)中，37 ℃、50 mL/L CO2的培养箱中培养，间隔2 天更换培养基1次。FBS DMEM培养液(美国Gibico公司)，CO2无菌培养箱(美国Thermo公司); lucat1 shRNA慢病毒载体及FPR2过表达质粒(ex-FPR2)由上海吉凯生物工程有限公司构建，逆转录试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，定量引物(上海吉凯生物工程有限公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，稀释基质胶(美国BD公司)。

1.2 SGC-7901、BGC-823、GES-1细胞lncRNA lucat1和FPR2 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。采用TRIzol法提取各细胞总RNA并检测RNA的纯度及浓度。将总RNA逆转录为cDNA，用ROCHE实时定量荧光PCR仪行实时荧光定量PCR扩增。lncRNA lucat1上游引物序列5′-ACCAGCTGTCCCTCAGTGTTCT-3′，下游引物序列5′-AGGCCTTTATCCTCGGGTTGCCT-3′；FPR2上游引物序列5′-GAGACCTCAGCTGGTTGTGC-3′，FPR2下游引物序列5′-ACCACCACTTCTGATCCATTCA-3′；内参U6上游引物序列5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3′，下游引物序列5′-CACTATTGCGGGCTGC-3′。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA lucat1和FPR2 mRNA相对表达量。

1.3 下调lucat1表达对胃癌细胞SGC-7901、BGC-823 FPR2 mRNA表达影响的观察 将体外培养的胃癌细胞SGC-7901、BGC-823分为观察组和对照组。观察组用Lipofectamine2000转染lncRNA lucat1 shRNA，按操作手册操作；对照组不转染。lncRNA lucat1 shRNA正义序列：5′-UUAAGAAGUAGAACACUGAGGGACA-3′，反义序列5′-UGUCCCUCAGUGUUCUACUUCUUAA-3′。转染48 h，采用1.2中的方法检测两组SGC-7901、BGC-823细胞FPR2 mRNA相对表达量。

1.4 转染lncRNA lucat1 shRNA及FPR2过表达质粒对胃癌细胞BGC-823侵袭和迁移能力影响的观察 将体外培养的BGC-823细胞分为A、B、C组。A组转染lncRNA lucat1 shRNA，B组转染lncRNA lucat1 shRNA和FPR2过表达质粒，方法同1.3。C组不转染。转染48 h，观察各组细胞侵袭和转移能力。① Transwell小室实验。在每个8 μm孔径的Transwell小室内加入50 μg ECM 胶进行包被，37 ℃无菌条件下放置6 h。ECM胶充分凝固后，上室接种细胞2×105/孔后加入无抗生素、无血清培养基，下室加入含10%血清的无抗生素培养基，继续培养 24 h。将小室取出，用无菌棉签擦拭去除上室内细胞，以1%结晶紫染液将小室多孔膜下表面的细胞染色，拍照。计数紫色染色的穿膜细胞数。②划痕实验。将细胞接种于6孔板，100 μL枪头垂直于孔板制作细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板3次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入无血清培养基，拍照记录。将培养板放入培养箱培养，48 h后再取出拍照，计算迁移距离(荧光显微镜拍照，以96孔中心阴影区域为参照，划痕在图片的正中)。

2 结果

2.1 SGC-7901、BGC-823、GES-1细胞lncRNA lucat1和FPR2 mRNA相对表达量比较 SGC-7901、BGC-823、GES-1细胞lncRNA lucat1相对表达量分别为3.651±0.332、3.023±0.331、1.000±0.098，FPR2 mRNA相对表达量分别为3.354±0.433、3.425±0.354、1.000±0.277。SGC-7901、BGC-823细胞lncRNA lucat1、FPR2 mRNA相对表达量均高于GES-1细胞(P均<0.05)。

2.2 下调lncRNA lucat1表达对SGC-7901、BGC-823细胞FPR2 mRNA表达的影响 观察组、对照组SGC-7901细胞FPR2 mRNA相对表达量分别为1.00±0.05、0.48±0.04，BGC-823细胞FPR2 mRNA相对表达量分别为1.00±0.04 、 0.48±0.04，两组比较P均<0.05。

2.3 转染lncRNA lucat1 shRNA及FPR2过表达质粒对胃癌细胞BGC-823侵袭和迁移能力的影响 Transwell小室实验显示，A、B、C组穿膜细胞数分别为(143±7)、(194±9)、(233±8)个，三组穿膜细胞数两两比较P均<0.05。划痕实验显示，A、B、C组细胞迁移距离分别为(0.342±0.027)、(0.534±0.021)、(0.652±0.029)mm，三组细胞迁移距离两两比较P均<0.05。

3 讨论

lncRNA表达改变是肿瘤发生的驱动因素之一。lncRNA可在不同水平调节基因表达[6]：部分lncRNA首先作为信号与蛋白质结合(如激素受体和转录因子)，然后复合物与启动子位点结合，调节下游基因表达； lncRNA可作为引导调控蛋白到靶向基因启动子位点的指引；部分lncRNA作为诱饵阻止调控蛋白与启动子位点结合，或作为支架来招募蛋白复合物。

lucat1又名SCAL1，定位于5号染色体，2013年首次在吸烟者的呼吸道上皮细胞中被发现，在非小细胞肺癌细胞系中高表达[7]。有文献报道，lucat1可通过降低人非小细胞肺癌组织p21和p57表达而调控肿瘤细胞周期和增殖[8]；并能诱导浆液性卵巢癌对顺铂的耐药[9]。Thai等[10]报道，lucat1可通过DNA甲基化调控甲基转移酶1(DNMT1)的稳定性，抑制抑癌基因表达，从而促进肿瘤的形成。Sun等[11]报道，miR-200c可通过RNA海绵的作用调节ABCB1和lucat1表达。目前lucat1在胃癌侵袭和迁移中的生物学作用和调控机制仍不清楚。本研究结果显示，与胃黏膜上皮细胞相比，BGC-823细胞lncRNA lucat1呈过表达；下调lncRNA lucat1表达可抑制细胞的侵袭和迁移能力。证实lncRNA lucat1过表达参与胃癌的侵袭和迁移。

FPR家族成员共包括FPR1、FPR2和FPR3，三者均在胃癌细胞中表达[12]。FPR2是一种典型的G蛋白偶联受体的化学吸引受体，通过与不同配体和不同细胞结合而被激活，其激活后可触发不同的信号通路：如磷脂酶C、蛋白激酶C、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶等[13，14]，这些通路均参与肿瘤细胞的侵袭和迁移。为研究lncRNA lucat1调控胃癌细胞侵袭和迁移能力的机制，本研究进一步观察了下调lncRNA lucat1表达对BGC-823细胞FPR2表达的影响，结果显示转染lncRNA lucat1 shRNA的观察组FPR2 mRNA相对表达量高于对照组。本研究还观察了转染lncRNA lucat1 shRNA及FPR2过表达质粒对胃癌细胞BGC-823侵袭和迁移能力的影响，结果显示共转染lncRNA lucat1 shRNA及FPR2过表达质粒的B组BGC-823细胞Transwell小室实验的穿膜细胞数和划痕实验的细胞迁移距离均大于转染lncRNA lucat1 shRNA的A组，表明lncRNA lucat1可能通过FPR2调控胃癌细胞侵袭和迁移。

综上所述，lncRNA lucat1可促进胃癌细胞的侵袭和迁移，其机制可能与促进FPR2表达有关，但其具体分子生物学机制仍需进一步研究探讨。lncRNA lucat1和FPR2有望成为胃癌诊断和靶向治疗的新靶点。

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