张宏展，陈培林，李观贵，孙青，熊风，万才云，黄菊，曾勇*

(1.深圳中山泌尿外科医院生殖中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳 518045；2. 深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045)

通过对存在受精失败高风险的患者行早期观察治疗，并对未出现第二极体的卵母细胞进行卵胞浆内单精子注射(早期补救ICSI)，是目前国内辅助生殖避免受精失败的常用方法[1]。尽管大量数据已经证明该方法在避免受精失败方面十分有效[2-4]，但是行早期补救ICSI可能会引起异常受精率的增加[2，5]，同时给患者带来更大的经济和精神压力，而较高的早补率还会增加胚胎学家的工作负担。因此若能通过某些参数筛选出早期观察治疗患者中可能存在受精失败高风险的人群，并对这部分人群的治疗方案进行改进，无论对患者还是对胚胎培养室的工作都是有利的。

正常形态前向运动精子总数(TNNPS)包含精子数量、精子前向运动能力以及精子形态学等信息[6]，已被证明与辅助生殖受精结局相关[6-9]，因此有潜力成为预测早期观察治疗患者受精失败的参数。本研究探讨利用TNNPS预测早期观察受精失败的可能性，并报道如下。

资料与方法

一、研究对象

选择2013年1月1日至2016年3月31日于本生殖中心行早期观察治疗的患者。入选标准：(1)第1治疗周期；(2)促排卵方案为标准方案或常规长方案。共计2 768例。本研究经伦理委员会批准通过，并且得到入选患者的知情同意。

二、研究方法

1.分组：将所有研究对象按TNNPS从小到大排序，根据排序的第25、50、75三个百分位点将研究对象分为4组，各692例，分别为A组：TNNPS≤2.76×106；B组：2.76×106

2.术前精液检测：参考WHO第5版手册[10]的标准化程序进行精液的采集及处理，采用Makler计数池(Sefi-Makeler，以色列)载样在SCA计算机辅助精液分析操作系统(Microptic，西班牙)下同时进行精子浓度及活力分析；精子形态学分析采用Diff-Quik快速染色液(Medion Diagnostics，瑞士)染色，根据WHO第5版手册的精子形态学诊断标准进行人工分析。

3.术前精液处理：男方禁欲3～7 d，于取卵日以手淫法取精，室温液化后，记录精液量、液化时间。密度梯度离心法处理精子，并采用CASA操作系统检测精子浓度、活动率、前向运动精子比例，然后置于37℃、5%CO2培养箱中备用。

4.指标参数计算：TNNPS=精液体积(ml)×精子浓度(106/ml)×正常形态精子百分比(%)×前向运动精子百分比(%)。

5.控制性促排卵和卵母细胞收集：促排卵采用本中心标准方案、常规长方案，当优势卵泡直径≥18 mm时，肌肉注射HCG(珠海丽珠制药)，注射后34～36 h左右行阴道B超穿刺取卵，卵母细胞放入培养液中培养直至授精。

6.早期观察：卵母细胞培养3～5 h后授精，加入精子量为每个卵母细胞1万个精子。受精后4 h去除卵丘细胞，观察第二极体排出情况，若4 h时出现第二极体卵母细胞≤30%，延长观察时间至6 h，若此时出现第二极体卵母细胞≤50%，则定义为受精失败，补行ICSI。

三、统计学处理

结 果

一、所有入选患者不同TNNPS分组一般资料比较

A、B、C、D组患者一般资料如女方年龄、男方年龄、不育年限、平均获卵数及女方体重指数(BMI)等均无显著性差异(P0.05)(表1)。

表1 所有入选患者各组一般临床资料(-±s)

二、所有入选患者不同TNNPS分组受精失败率比较

对不同TNNPS组患者的受精失败率进行统计分析发现，B、C、D 3组的受精失败率无显著性差异(P0.05)，而A组的受精失败率显著高于B、C、D组(P<0.05)(表2)。

表2 所有入选患者各组患者受精失败率比较(%)

注：与A组比较，*P<0.05

三、TNNPS≤3.0×106的各组患者一般资料比较

TNNPS≤3.0×106的研究对象共751例，以0.5×106为单位细分为6组，Ⅰ～Ⅵ组患者一般资料如女方年龄、男方年龄、不育年限、平均获卵数及女方BMI等无显著性差异(P0.05)(表3)。

四、TNNPS≤3.0×106的各组患者受精失败率比较

对TNNPS≤3.0×106的各组患者的受精失败率进行统计分析发现，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 4组的受精失败率无显著性差异(P0.05)，而Ⅰ组、Ⅱ组受精失败率均显著高于其他4组(P<0.05)(表4)。

五、多因素Logistic回归分析

以受精失败为因变量，以女方年龄、男方年龄、不育年限、平均获卵数、女方BMI、TNNPS≤1.0×106做多因素Logistic回归分析，结果显示女方年龄、男方年龄、不育年限、平均获卵数、女方BMI对早期观察受精失败的发生均无统计学意义；而TNNPS≤1.0×106[OR=25.422，95%CI(17.702-36.508)]对早期观察受精失败的发生有统计学意义(P<0.05)，即TNNPS≤1.0×106时早期观察受精失败的概率较高(表5)。

表3 TNNPS≤3.0×106的各组患者一般资料比较(-±s)

表4 TNNPS≤3.0×106的各组患者受精失败率比较(%)

注：与Ⅰ、Ⅱ组比较，*P<0.05

表5 多因素Logistic回归分析各因素对早期观察受精失败的影响

讨 论

辅助生殖治疗过程中存在着受精失败的风险[11-12]，目前大量研究及临床信息证明对短时受精早期观察未出现第二极体的卵母细胞行早期补救ICSI，可以得到良好的胚胎培养结局和妊娠结局，是避免受精失败的有效手段[13-16]。尽管早期补救ICSI在避免受精失败方面效果显著，但有研究认为短时受精因为提早去除颗粒细胞，干扰了正常受精，可能导致异常受精率增加[2，5]。而且由于需要承担短时受精和早期补救ICSI两部分费用，使这部分患者承受了更大的经济和精神压力，同时，较高的早补率也增加了胚胎培养室的工作压力，因此有必要找到一个指标将短时受精早期观察治疗方案患者中受精失败高风险人群筛选出来，并对这部分人群的治疗方案进行改进。

TNNPS包含众多精液相关信息，有潜力成为一个独立的精液质量评价指标指导辅助生殖[7]。张云山等[6]的研究证明，TNNPS与宫腔内人工授精(IUI)临床妊娠结局关系密切；孙青等[9]的研究则表明，TNNPS对于IVF受精结局具有一定的预测价值；而蔡靖等[7]的研究证明当TNNPS≤1.8×106时，IVF存在着较高的低受精风险。尽管这些研究的侧重点不同，但均可以说明TNNPS与IVF受精结局密切相关，因此我们猜想TNNPS可能与早期观察治疗患者的受精失败率存在一定的关系，进而有可能成为预测早期观察受精失败的参数。

为了验证我们的猜想，我们回顾性分析了2013年1月1日至2016年3月31日在我院行早期观察治疗的2 768个周期。所有入选患者按照TNNPS的不同分成4组，比较各组患者的一般临床资料和受精失败率。结果显示，不同TNNPS的4组患者女方年龄、男方年龄、不育年限、平均获卵数及女方BMI等无显著性差异(P0.05)，但是TNNPS≤2.76×106的受精失败率达到23.27%，显著高于其他3组，这预示着TNNPS≤2.76×106组患者存在着更高的受精失败风险。

由于A组TNNPS为0～2.76×106，范围较大，为了提高研究的精确性，我们将TNNPS≤3.0×106的751例患者，以0.5×106为基本单位细分为6组，并比较各组患者的一般临床资料和受精失败率。结果显示，6组患者一般临床资料均无显著性差异(P0.05)，对于TNNPS>1.0×106的4组患者，受精失败率分别为12.84%、14.04%、16.50%、11.34%，两两之间比较也无显著性差异(P0.05)，而TNNPS≤1.0×106的两组患者受精失败率分别高达43.31%和28.79%，均显著高于TNNPS>1.0×106的4组患者(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示TNNPS≤1.0×106是影响早期观察受精失败的重要独立因子，当早期观察患者TNNPS≤1.0×106时受精失败风险增加。

综上所述，在行早期观察治疗方案的患者中，TNNPS与受精结局有一定的相关性，低TNNPS对受精失败有一定的预测价值。其中TNNPS≤1.0×106的人群受精失败的可能性较大，建议对这部分患者改行ICSI治疗方案以得到更好的受精结局，同时减轻这部分患者的经济和精神压力，以及胚胎学家的工作压力。

【参 考 文 献】

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