于晓晨，梁剑青，王嫚娜，牛祖彪，陈昭烈，孙强

军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

细胞内的着丝粒相关蛋白检查点蛋白（checkpointprotein，CP）是细胞分裂监控体系中的重要组成部分，有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitoticarrest deficientprotein2，MAD2）作为CP蛋白的重要成员，在控制有丝分裂周期的正常进行中发挥着重要作用[1-2]。MAD2可以与CDC20结合[3]，共同参与有丝分裂纺锤体检查点复合物（spindleassemblycheckpoint，SAC）的形成[4]，抑制有丝分裂中期向后期的进展，防止染色体分离错误。当有丝分裂中期姐妹染色单体正确地连接于纺锤体上，MAD2与CDC20解离，SAC复合物失活，CDC20激活泛素连接酶分裂后期促进复合体或循环体（APC/C），促进细胞周期阻滞蛋白的降解，有丝分裂中期向后期正常进展；若有丝分裂中期异常，则会激活SAC复合物，将细胞阻滞在分裂中期[5-6]。MAD2的异常会导致纺锤体检查点的功能减弱或消失，无法监控肿瘤细胞内异常的动粒-微管结合，使染色体出现异常分离，造成细胞核型的非整倍体异常而导致肿瘤[7-8]。因此，MAD2与肿瘤的发生密切相关[4]。

为动态追踪细胞有丝分裂中期阻滞，实时标记周期阻滞的细胞，并检测MAD2分子在细胞分裂周期里的亚细胞分布变化，我们构建了MAD2与绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白，并初步检测了EGFP-MAD2融合蛋白表达对细胞周期的影响。结果表明所构建的重组质粒能够有效表达EGFP-MAD2融合蛋白，并诱导细胞在G2/M其发生阻滞，为随后的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞293FT细胞由本实验室保存；大肠杆菌感受态细胞Trans10、dNTPs、TaqDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；包含目的基因MAD2的质粒购自义翘神州生物技术有限公司；pQCXIP-EGFP-N1载体由本实验室提供；pGEM-T载体购自Promega公司；实验所需的Q5超保真DNA聚合酶，T4DNA连接酶，EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶及Cutsmart酶切缓冲液均购自NewEnglandBiolabs公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；脂质体Lipo⁃fectAMINE2000购自Invitrogen生命技术有限公司；高糖DMEM培养基购自Macgene公司；胎牛血清FBS购自PAN-Biotech公司；PCR引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。

1.2 pQCXIP-EGFP-MAD2表达载体的构建

分别以pQCXIP-EGFP-N1载体及包含目的基因MAD2的质粒为模板，设计2对PCR扩增引物，其中EGFP的3′端引入限制性酶切位点BamHⅠ，MAD2的5′端引入限制性酶切位点EcoRⅠ，通过PCR扩增技术获得EGFP和MAD2基因片段。为了提高融合基因表达产物的稳定性，引物设计时增加了同源互补的连接肽（Linker）。引物为EGFP-F（GGATC⁃CATGGTGAGCAAGGGCGAG）、EGFP-R（CCTCCTCC TCCTCCTCCGTCGACCTTGTACAGCTCGTCCATGCC）、MAD2-F（TCGACGGAGGAGGAGGAGGAGGAATGGCGC TGCAGCTCTC）、MAD2-R（GTAGAATTCTCAGTCATT GACAGGAATTTTGTAGGCC）（斜体字部分为同源互补序列）。EGFP和MAD2扩增产物电泳后回收混合作为模板，用EGFP-F和MAD2-R引物对进行重叠PCR，扩增获得EGFP-MAD2融合基因。PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸2min。

将EGFP-MAD2融合片段克隆入pGEM-T载体进行测序测定。取测序正确的pGEM-TEGFP-MAD2质粒和表达载体pQCXIP-EGFP-N1，分别经限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ和BamHⅠ/MfeⅠ双酶切，利用EcoRⅠ和MfeⅠ是同尾酶的原理，将融合片段EGFP-MAD2插入pQCXIP-EGFPN1载体，获得重组表达载体pQCXIP-EGFP-MAD2（图1）。

1.3 质粒转染293FT细胞

293FT细胞按1.5×104/孔接种于12孔板内，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2的培养箱中常规培养约24h，细胞生长至汇合度50%～60%时，将pQCXIP-EGFP-MAD2表达质粒与脂质体混合共转染293FT细胞，质粒与LipofectAMINE2000的用量比为0.5 μg∶1 μL（转染按说明书操作）。对照组转染空载体pQCXIPEGFP-N1。

图1 pQCXIP-EGFP-MAD2重组表达载体的构建示意图

1.4 融合基因表达检测与细胞周期分析

转染72h后用荧光显微镜（NikonEclipse）同时采集对照质粒和pQCXIP-EGFP-MAD2质粒转染的293FT细胞图像（DIC和FITC通道），观察荧光蛋白表达情况。

荧光显微镜采集图像后回收细胞，用流式细胞仪分析细胞周期。消化细胞制备细胞悬液，2000r/min离心5min；弃上清，用0.5mL1%多聚甲醛重悬，避光固定10min；1000r/min离心3 min，弃上清，用 3～5mLPBS清洗 3次，PBT（以PBS为溶剂，含0.1%TritonX-100，0.5%BSA）清洗1次；再次离心后用PI染液（以PBT为溶剂，含100 μg/mLRNaseA，50 μg/mL碘化丙啶）重悬细胞，避光37℃孵育1h或4℃过夜；PBS清洗2次后重悬细胞，调整细胞密度约为106/mL，用流式细胞仪（BectonDickinson）进行分析。

2 结果

2.1 pQCXIP-EGFP-MAD2表达载体的构建与鉴定

以pQCXIP-EGFP-N1载体及含有MAD2基因的质粒为模板，PCR扩增EGFP和MAD2的基因片段，产物长度分别为746和650bp。通过重叠PCR将2个片段拼接为EGFP-MAD2，产物长度为1374bp，DNA凝胶电泳验证产物与理论基因片段长度一致（图2A）。将EGFP-MAD2基因片段与pGEM-T载体连接，获得重组质粒pGEM-TEGFP-MAD2，通过测序验证EGFP-MAD2基因序列正确，无突变或缺失。取测序验证正确的pGEM-T-EGFP-MAD2质粒和表达载体pQCXIPEGFP-N1，经双酶切连接，将融合片段EGFPMAD2插入pQCXIP-EGFP-N1载体，获得重组表达载体pQCXIP-EGFP-MAD2。随机挑取8个单菌落进行菌液PCR验证，结果显示4号和7号克隆的目的基因连接成功（图2B），取7号单克隆测序分析，测序结果表明EGFP-MAD2基因序列正确，无突变或缺失（图2C）。

2.2 EGFP-MAD2融合蛋白在293FT细胞中的表达

将pQCXIP-EGFP-MAD2质粒通过脂质体法转染293FT细胞，72h后在荧光显微镜下可见293FT细胞中绿色荧光蛋白的表达（图3）。转染pQCXIP-EGFP-MAD2质粒的细胞绿色荧光蛋白表达效率和表达水平都显著高于对照组pQCXIPEGFP-N1，且视野中容易观察到被阻滞在有丝分裂中期的细胞（呈圆球状，图3箭头所示），约占细胞总数的1/3，提示MAD2基因表达可能阻滞细胞G2/M期的进展。

图2 pQCXIP-EGFP-MAD2载体构建及序列分析

2.3 流式细胞术分析EGFP-MAD2表达对293FT细胞周期的影响

由于对照载体pQCXIP-EGFP-N1与重组载体pQCXIP-EGFP-MAD2的绿色荧光表达量不同，通过设定相同的阀值M1获得绿色荧光细胞群，排除未表达或表达量低的细胞干扰，进一步分析细胞周期。流式分析结果（图4）显示，超过一半的EGFP-MAD2表达细胞处于G2/M期（54.1%），显著多于EGFP对照组的22.4%，表明融合了EGFP的MAD2蛋白仍然能够有效地诱导细胞发生G2/M阻滞。

3 讨论

MAD2作为有丝分裂纺锤体检测点SAC复合物的关键蛋白，在调控细胞正常有丝分裂方面发挥着重要作用[9]，当细胞周期进程中出现DNA损伤或复制受阻等异常事件时，监控点激活，及时中断细胞周期运行，防止异常的染色体分离[10]。MAD2基因影响多种肿瘤如胃癌、大肠癌、结直肠癌、喉鳞状细胞癌等的发生和发展，临床标本分析显示MAD2的表达与多种肿瘤的预后密切相关，可以作为肿瘤恶性程度判定、预后分析及肿瘤临床治疗的重要参考指标[4,11-14]。而沉默MAD2基因的表达，能够显著抑制肠癌细胞增殖、抑制细胞迁移、诱导细胞凋亡。因此，MAD2基因被认为是肿瘤防治的一个潜在靶点[15-16]。

图3 EGFP-MAD2融合蛋白在293FT细胞中表达

图4 MAD2表达导致细胞周期G2/M期阻滞

为实现实时追踪MAD2蛋白分子在细胞内的分布定位，指示MAD2过表达的细胞，我们将MAD2与EGFP融合构建融合蛋白，考虑到EGFP蛋白的分子略大于MAD2，直接融合后可能会影响MAD2分子的折叠和功能发挥，我们在2个分子间加入了一段8个氨基酸残基的连接短肽，鉴于以往文献中将短的标签（如HA等）融合于MAD2分子的N端，我们将EGFP分子也融合在MAD2分子的N端，并在EGFP分子的起始密码子前端设计了Kozak序列以增强融合蛋白的翻译效率。将构建的EGFP-MAD2融合基因表达载体转入293FT细胞后，荧光显微镜下可以看到与对照EGFP相当甚至更强的绿色荧光信号，提示EGFP-MAD2融合蛋白得到了有效表达，与此相对应，流式细胞分析显示表达EGFP-MAD2融合蛋白的细胞在G2/M期的比例显著增加，提示融合蛋白仍然具有诱导细胞发生G2/M阻滞的功能。以上结果表明，我们构建了可用于活细胞成像和实时动态追踪的EGFP-MAD2融合蛋白，而EGFP在MAD2分子N端的融合并不影响其细胞学功能，可以用于后续的功能研究。