乐静 李枫林 牧启田 袁娇娇 裴仁治 金洁 陆滢

高三尖杉酯碱（Homoharringtonine，HHT）是从我国植物三尖衫中提取的一种具有细胞毒性的生物碱，目前在国内是治疗急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的常规药物之一，其中HHT联合阿克拉霉素、阿糖胞苷的HAA方案是治疗中青年AML的一线治疗方案[1]。近年来有学者发现HHT联合不同药物可以对特定的AML细胞株发挥协同抑制作用，例如HHT联合FLT3-ITD抑制剂索拉菲尼可以协同抑制FLT3-ITD突变的AML细胞株[2]。JQ1是近年来合成的靶向表观遗传蛋白BRD4的小分子抑制剂，它具有广泛的抗AML作用[3]。本研究观察HHT联合JQ1对AML细胞株的杀伤作用，以探讨HHT联合JQ1治疗AML的可行性，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器 AML细胞株Kasumi-1及Mv4-11（由浙江大学医学院附属第一医院馈赠），Gibco FBS的IMDM培养基及1640培养基（美国Hyclone公司），HHT、JQ1（美国 Sigma公司），MTS细胞增殖测试试剂盒（批号：0000282257，美国Progema公司），Annex－inV-FITC/PI凋亡测试试剂盒（批号：83001302，上海联科生物公司），兔抗人 Gapdh、Bcl-2、Caspase-3，Parp 一抗及兔二抗（美国CST公司）。安全柜（型号：1374，美国Thermo公司），CO2培养箱（型号：3111，美国 Thermo公司），电热恒温水槽（型号：DK-8D，上海精宏公司），高速离心机（型号：Legend Micro17R，美国 Thermo公司），倒置生物显微镜（型号：CKX31，日本奥林巴斯公司），酶联免疫检测仪（型号：3001，美国Thermo公司），流式细胞仪（型号：FACS-Cantoll，美国BD公司），蛋白印记检测系统（型号：ChemiDoc-MP，美国BioRad公司）。

1.2 细胞培养 将Mv4-11细胞株培养在含10%FBS的IMDN培养液中，Kasumi-1细胞培养在含10%FBS的 1640 培养液中，在 37℃、75%N2、5%CO2、20%O2的环境中培养，待细胞进入对数生长期进行实验。

1.3 MTS法检测单药及两药联合对AML细胞株的抑制作用 （1）单药细胞毒性实验：Mv4-11、Kasumi-1细胞铺24孔板，细胞铺板密度为1.0×105/ml。铺板48h后移板至96孔板，加入20μl MTS，4h后用酶标仪检测490nm 的 OD 值 。 HHT 浓 度 采 用 1、2、4、8、16、32、64nmol/L，JQ1 浓度采用 50、100、200、400、800nmol/L。细胞存活率=（用药组OD值-空培养基OD值）/（对照组OD值-空培养基OD值）×100%，根据公式计算各个浓度作用72h的细胞存活率。利用Graphpad Prism软件计算 HHT、JQ1 对 AML 细胞株的半数抑制浓度（IC50）。（2）两药联合细胞毒性实验：根据HHT及JQ1单药的IC50，对于 Mv4-11 细胞，HHT 浓度采用 2、4、8nmol/L，分别与100、200、400nmol/L 的 JQ1联合；对于 Kasumi-1细胞，HHT 浓度采用 5、10、15、20nmol/L，分别与 100、200、300、400nmol/L的JQ1联合。细胞铺板密度为1.0×105/ml，铺板72h后移板至96孔板，加入20μl MTS，4h后用酶标仪检测490nm的OD值。根据上述细胞存活率公式，计算两药联合作用72h的细胞存活率。（3）细胞增殖实验：Mv4-11、Kasumi-1细胞铺96孔板，细胞铺板密度为5.0×103/100μl，铺板 0、24、48、72、96h，加入 20μl MTS，4h后用酶标仪测490nm的OD值。所有实验重复3次，取平均OD值。对于Mv4-11细胞，HHT浓度采用4nmol/L，与200nmol/L的JQ1联合；设置空白对照组、HHT组、JQ1组、两药联合组。对于Kasumi-1细胞，HHT浓度采用15nmol/L，与300nmol/L的JQ1联合；设置空白对照组、HHT组、JQ1组、两药联合组。细胞增殖倍数=每个时间点OD值/0h的OD值，根据公式计算每组各个时间点的细胞增殖倍数，同时利用Graphpad Prism软件描绘细胞生长曲线。

1.4 流式细胞仪检测两药联合对AML细胞株凋亡的作用 Mv4-11细胞的HHT浓度采用4nmol/L，JQ1浓度采用200nmol/L；Kasumi-1细胞的HHT浓度采用15nmol/L，JQ1浓度采用300nmol/L，铺板6孔板，细胞铺板密度为 1.0×105/ml；培养 48h 后，1 500r/5min 离心，收集细胞团块。用冷的PBS洗细胞团块2次，加入500μl Binging Buffer悬浮细胞，再加入5μl AnnexinV-FITC和10μl PI混匀，室温避光15min。1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.5 Western blot法检测两药联合对凋亡相关蛋白的作用 Mv4-11细胞HHT浓度采用4nmol/L，JQ1浓度采用 200nmol/L；Kasumi-1细胞的 HHT浓度采用15nmol/L，JQ1浓度采用300nmol/L。铺板6孔板，细胞铺板密度为1.0×105/ml；培养48h后，1 500r/5min离心，收集细胞团块。加入RIPA裂解液充分裂解细胞团块，冰上孵育30min，12 000r/15min离心，取上清液于EP管。采用BCA法检测蛋白浓度，蛋白上样量为40μg。SDS-PAGE凝胶电泳后PVDF膜转膜，1∶1 000过夜孵育一抗，1∶5 000孵育辣根过氧化物酶二抗，显色并用BIO-RAD凝胶成像系统采集并分析数据。

1.6 统计学处理 应用Graphpad Prism统计软件。计量资料用表示，组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HHT、JQ1单药及两药联合作用AML细胞株的存活率 不同浓度HHT及JQ1处理AML细胞株Mv4-11、Kasumi-1后，证实两药联合对AML细胞株有生长抑制作用。HHT、JQ1作用Mv4-11细胞的IC50分别为7.2（95%CI：5.6~9.2）、345.7（95%CI：333.2~358.6）nmol/L，作用Kasumi-1细胞的IC50分别为22.3（95%CI：20.75~23.94）、356.9（95%CI：338.0~374.9）nmol/L。对于 Mv4-11细胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1单药及两药联合作用72h的细胞存活率分别为62.5%、93.1%和42.4%，差异有统计学意义（P＜0.05）；8nmol/L的 HHT、400nmol/L的JQ1单药及两药联合作用72h的细胞存活率分别为24.0%、62.1%和8.8%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1a。对于Kasumi-1细胞，5nmol/L的HHT、100nmol/L的JQ1单药及两药联合作用72h的细胞存活率分别为97.0%、113.3%和44.4%，差异有统计学意义（P＜0.05）；10nmol/L的 HHT、200nmol/L的 JQ1单药及两药联合作用72h的细胞存活率分别为55.0%、108.0%和26.3%，差异有统计学意义（P＜0.05）；15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1单药及两药联合作用72h的细胞存活率分别为33.2%、95.6%和15.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）；20nmol/L 的 HHT、400nmol/L 的JQ1单药及两药联合作用72h的细胞存活率分别为25.1%、62.5%和9.0%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1b。

图1 HHT、JQ1单药及两药联合作用AML细胞株的存活率（a：2、4、8nmol/L的HHT与100、200、400nmol/L的JQ1单药及两药联合作用 Mv4-11 细胞 72h 的存活率；b：5、10、15、20nmol/L 的 HHT 与 100、200、300、400nmol/L 的 JQ1 单药及两药联合作用 Kasumi-1 细胞72h的存活率）

2.2 HHT、JQ1单药及两药联合对AML细胞株增殖的抑制作用 进一步选择4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1单药及两药联合作用Mv4-11细胞，15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1单药及两药联合作用Kasumi-1细胞，以观察单药及两药联合对AML细胞株增殖的抑制作用。生长曲线显示HHT联合JQ1作用于2个细胞系后，细胞生长速度明显慢于单药作用（均P＜0.05），见图2。

图2 HHT、JQ1单药及两药联合对AML细胞株增殖的抑制作用（a：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1单药及两药联合对Mv4-11细胞增殖的抑制作用；b：15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1单药及两药联合对Kasumi-1细胞增殖的抑制作用）

2.3 HHT、JQ1单药及两药联合对AML细胞株凋亡的诱导作用 对于Mv4-11细胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1单药及两药联合作用后，细胞凋亡率分别为27.7%、12.8%和59.6%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3ab。对于Kasumi-1细胞，15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1单药及两药联合作用后，细胞凋亡分别为9.1%、8.5%和31.2%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3c-d。

2.4 HHT、JQ1单药及两药联合对AML细胞株凋亡相关蛋白表达的影响 由于HHT联合JQ1可以明显诱导AML细胞株的凋亡，笔者应用Western blot法检测了凋亡相关蛋白表达。对于Mv4-11细胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1两药联合较单药能明显抑制Bcl-2蛋白表达，促进Caspase-3蛋白表达，见图4a。对于Kasumi-1细胞，15nmol/L的 HHT、300nmol/L的 JQ1两药联合较单药能明显抑制Bcl-2蛋白表达，促进Parp的降解而出现裂解条带，见图4b。

3 讨论

图3 HHT、JQ1单药及两药联合对AML细胞株凋亡的诱导作用（a-b：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1单药及两药联合对Mv4-11细胞凋亡的诱导作用；c-d：15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1单药及两药联合对Kasumi-1细胞凋亡的诱导作用）

在我国，HHT用于治疗AML已有20余年历史。目前HAA方案作为＜60岁患者一线治疗方案而写入中国AML患者诊疗指南，同时作为候选治疗方案而写入复发难治的AML患者诊疗指南中[1，4-5]。以HHT为基础药物联合经典及新型的小分子抑制剂对AML患者的疗效是近年来研究的方向，以探索AML治疗的新方案。JQ1是表观遗传蛋白BRD4的靶向抑制剂，单药对白血病干、祖细胞及多种AML细胞株具有明显的抑制作用[3]。本文通过研究HHT联合JQ1对AML细胞株的作用，以探索HHT联合JQ1的可行性。

BRD4是近年来发现的BET家族的一员。研究表明BET蛋白家族可能与一些疾病通路相关，因此认为其可作为潜在的药物治疗靶点，其中最显著的是BRD4[6]。JQ1是靶向BRD4的新合成的小分子抑制剂，最早由Filippakopoulos研究小组合成并应用于人鳞状细胞癌，结果显示JQ1通过与溴结构域竞争性结合而抑制BRD4与组蛋白乙酰化赖氨酸残基的结合，促进鳞状细胞癌的分化并显示特殊的抗增殖作用[7]。进一步研究表明，JQ1对血液系统恶性肿瘤多发性骨髓瘤（MM）[8]、非霍奇金淋巴瘤[9]、急性淋巴细胞白血病[10]具有抑制作用。Zuber等[11]用RNAi干扰的方法证实了BRD4抑制在AML中可作为治疗靶点；体外实验结果显示白血病干、祖细胞及多种AML细胞株对JQ1敏感，可引起白血病细胞的生长抑制及凋亡，虽然对正常骨髓细胞株也有一定的抑制，但相较于AML细胞株需要更高的IC50值；同时发现HHT联合阿糖胞苷可以发挥协同抗AML细胞株的作用。本研究结果也验证了JQ1对AML细胞株Mv4-11及Kasumi-1均有明显抑制作用，但是目前并无相关文献研究JQ1联合HHT对AML细胞株的作用。

图4 HHT、JQ1单药及两药联合对AML细胞株凋亡相关蛋白表达的影响（a：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1单药及两药联合作用Mv4-11细胞48h对Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响；15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1单药及两药联合作用Kasumi-1细胞48h对Bcl-2、Parp蛋白表达的影响）

本研究结果发现，HHT联合JQ1对AML细胞株的抑制作用明显强于单药，且两药联合可以明显抑制AML细胞株的生长；提示HHT联合JQ1是治疗AML的可行方案。本文进一步探索HHT联合JQ1对AML细胞株凋亡的作用，结果表明HHT联合JQ1对AML细胞株凋亡的诱导作用明显强于单药，Western blot检测又发现HHT联合JQ1相较于单药可以明显抑制Bcl-2蛋白表达，并激活Caspase-3蛋白表达，引起Parp的裂解。Bcl-2是凋亡途径中重要的凋亡抑制因子，细胞发生凋亡可以抑制其表达水平，且细胞在发生凋亡时伴随Caspase-3的激活并引起Parp的降解，从而促进细胞的凋亡[12]。

综上所述，HHT联合JQ1可以增强抗AML细胞株的作用，促进AML细胞株的凋亡，是有效的联合方案。但具体作用机制及临床应用的可行性有待进一步研究。

4 参考文献

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