梁小婷 综述 范慧敏 刘中民 审校

(1.同济大学附属东方医院干细胞转化医学产业基地，上海 200120； 2.同济大学附属东方医院心力衰竭研究所，上海 200120)

心血管疾病是一种严重威胁人类健康的疾病，发病率在全球非传染性疾病中居首位。根据2016年美国心脏协会(American Heart Association，AHA)的统计数据，美国的心力衰竭患者占人口总数的1.5%～2.0%，每100 000人中有222.9例死于心血管疾病[1]；而在中国心血管病患病率呈持续上升趋势，死亡率居疾病死亡构成的首位[2]。心力衰竭是各种心血管疾病的严重阶段或终末阶段，其特点为有功能的心肌细胞数量减少和心功能低下。各种改善冠状动脉血供的内外科治疗能挽救少部分濒死的心肌细胞；但对已经坏死或无功能的心肌细胞没有效果。心脏移植作为治疗心力衰竭的终极手段，又存在供体严重不足的问题，很多患者在等待合适供体的过程中死亡。20世纪90年代干细胞技术的出现与成熟，为终末期心力衰竭患者的治疗带来了新的曙光。干细胞移植是指将干细胞导入人心脏组织，促使其在心肌内存活、增殖、分化，成为具有类心肌或血管形态与功能的细胞，以替代坏死和丧失功能的心肌细胞，增强和改善心功能，抑制心室的负性重构，阻止或延缓心力衰竭患者病情的恶化与发展。干细胞移植有望为终末期心力衰竭患者争取等待供体的宝贵时间甚至完全替代心脏移植，已成为当前心血管病领域研究的热点。

1 干细胞定义

干细胞是一类具有自我更新复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，能够产生高度分化的功能细胞。干细胞具有两个重要的生物学特性，其一是自我更新能力，是指干细胞通过对称或者不对称分裂产生至少一个保留干细胞特性子细胞的过程，是维持干细胞多向分化潜能的基础；其二是定向分化，即在一定的条件下，干细胞可被诱导分化成机体内具有特化形态和特化功能的细胞，进而形成各种类型的组织和器官。

根据来源的不同，干细胞可分为两大类(图1)：胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)及成体干细胞，两者特点见表1。

2 ESC

图1 干细胞分类

ESC是全能细胞，具有分化成三个胚层细胞的能力。1981年，Evans、 Kaufman等第一次从小鼠囊胚的内细胞团中分离出了ESC，这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代，同时还保持其全能性。研究证实ESC可分化为有功能的心肌细胞、神经元、胰岛细胞等。然而，尽管ESC在再生医学中有巨大的潜力，由于在来源上的伦理问题及其恶性转化潜力，到目前为止，只有法国开展了一项有关ESC治疗心力衰竭的临床研究[3]。在该研究中，科学家将ESC分化为心肌祖细胞(embryonic stem cell-derived cardiac progenitors)后，包裹在纤维蛋白补片中，移植到心力衰竭患者的心外膜与心包膜中间的腔隙中。术后3个月的疗效评估显示患者心力衰竭症状得以改善，纽约心脏病学会心功能分级(New York Heart Association Functional Classification,NYHA)从Ⅲ级降至Ⅰ级，左室射血分数从26%提高至36%，且没有观察到心律失常、肿瘤形成等并发症。

3 iPSC

2006年，Yamanaka等利用病毒载体将4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)转入成年老鼠的皮肤细胞中，使其重编程并获得一簇类似于ESC的新型细胞，即iPSC。iPSC在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与ESC相似，但又没有来源及伦理问题，为干细胞的基础研究及临床疾病治疗带来了新的希望。日本科学家率先完成首例iPSC临床试验，他们将黄斑变性患者的皮肤细胞重编程为iPSC，进一步分化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞，将这些RPE细胞植入70岁高龄女性患者右眼中。术后1年证明自体iPSC有效遏制了黄斑变性病情的恶化，且没有观察到副作用[4]。虽然第二例入组患者因在iPSC中发现基因突变而终止了移植计划，但在首例患者中获得的成功已让人们看到了iPSC在严重疾病治疗中的巨大潜力。2017年3月，日本随即批准了实施将异体iPSC制作的视网膜细胞移植给严重眼疾患者的手术。2017年7月，大阪大学提出使用iPSC细胞制成的心肌细胞进行移植以治疗心脏病的临床实验申请，计划用iPSC诱导分化为心肌细胞，再制成2～3片细胞膜片(cell sheet)，重叠后移植到心瓣膜闭锁不全患者的心脏中。该技术目前已在动物实验中取得成功，可明显改善心脏功能，这是世界上首次提出将iPSC用于治疗心脏病。

关于iPSC/ESC对心力衰竭的治疗效果，多个课题组在大动物实验中进行了尝试。2013年，Kawamura等[5]将人iPSC分化的心肌细胞长成细胞贴片，与带蒂大网膜共移植到猪心脏的受损区域，术后2个月发现大网膜共移植可促进人iPSC分化的心肌细胞存活，移植区域周围血管生成增加。2014年，Murry等将人ESC分化的心肌细胞植入受损的豚尾猕猴心脏内，梗死区域可观察到心肌再生，移植细胞与心脏存在机电耦合，但因人ESC分化的心肌细胞功能不成熟，移植后引起心律不齐[6]。iPSC/ESC来源的心肌细胞移植，可有效替换心肌梗死后凋亡或坏死的心肌细胞，相比于其他种类的细胞，是一种更严谨的“细胞替代治疗”，而如何促进iPSC/ESC来源的心肌细胞的成熟，降低移植后心律不齐的发生率，是目前的研究热点和进行大规模临床转化的关键。

表1 ESC及成体干细胞特点

4 成体干细胞

4.1 骨骼肌成肌细胞

骨骼肌成肌细胞来源于骨骼肌卫星细胞，具有易获得、可体外扩增、抗低氧的特点，最早被认为是心肌再生较为理想的细胞来源。在心肌梗死动物模型中，骨骼肌成肌细胞移植后可形成骨骼肌样结构，提高心肌收缩力，减轻心室负性重构及心肌纤维化，改善心脏功能。在临床试验中，成肌细胞直接注射可改善缺血性心肌病患者的NYHA心力衰竭分级、射血分数、6分钟步行距离、明尼苏达心力衰竭生活质量调查表评分(Minnesota living with heart failure questionnaire，MLHFQ)等，显示出一定的治疗效果[7]。然而由于对成肌细胞移植所致室性心律失常的疑虑，成肌细胞在临床试验的开展中遇到了巨大的瓶颈。一项临床研究(MAGIC trial)针对这个问题进行了如下试验设置：该试验共入组了98例左室功能不全的心肌梗死患者，在对患者实施成肌细胞移植前，先安置植入型心律转复除颤器以防止室性心动过速的发生。结果表明成肌细胞移植组较安慰剂组的心律失常发生率高，然而并未观察到该细胞有提高心功能的效应[8]。因此，考虑到在临床应用中的风险性及效应的不确定性，而在近年研究中又出现了更为安全有效、更有应用潜力的干细胞类型，有关骨骼肌成肌细胞在心力衰竭方面的研究热度逐渐下降。

4.2 骨髓源性干细胞

骨髓是造血干细胞和非造血干细胞的共同来源，其中多种细胞在心脏再生领域中都有巨大潜力(单核细胞、间充质干细胞、造血干细胞等)，由于来源易得，近年来在临床前和临床研究中获得了最多的关注。

4.2.1 骨髓单核细胞

第一个应用骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cell，BM-MNC)的临床试验始于2001年。一例46岁的患者在心肌梗死6 d后接受了自体BM-MNC冠状动脉内注射，细胞移植10周后，心肌梗死面积显著缩小，心脏功能显著提高了20%～30%。随后一系列的小规模Ⅰ期临床试验也肯定了这种细胞疗法的易行性和安全性。2004年，德国科学家报道了一项随机对照、开放标签的试验研究结果：该试验共入组ST段抬高型心肌梗死患者60例(30例对照组，30例细胞治疗组)，在经皮冠脉介入术后4.8 d接受自体骨髓有核细胞冠状动脉内注射，移植6个月后细胞移植组左室射血分数较对照组提高了6%，且细胞移植不会提高临床意外事件的风险[9]。2017年，该研究团队又报道了Ⅱ期随机双盲临床试验的研究结果，重新评估并探讨了骨髓有核细胞的治疗效果、剂量以及γ射线预处理细胞对其疗效的影响，该试验入组了153例ST段抬高型心肌梗死患者，在经皮冠脉介入术后(8.1±2.6)d接受了自体骨髓有核细胞移植，结果显示细胞移植6个月后左室射血分数较对照组仅提高了1%，γ射线预处理不影响细胞疗效[10]。另外的一些临床研究亦表明BM-MNC对急性心肌梗死或充血性心力衰竭均无明显治疗效果[11-12]。这些有争议的数据使人们对BM-MNC作为再生治疗工具产生了质疑。

4.2.2 骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,BM-MSC)具有来源易得、扩增快、免疫原性低的特点。目前应用间充质干细胞治疗心力衰竭的临床试验也在各国开展。美国迈阿密大学米勒医学院报道了BM-MSC对缺血性心肌病的疗效。该试验入组了31例缺血性心肌病患者，除了比较自体及异体BM-MSC的疗效，还对注射细胞的数量进行了探讨(20万、100万、200万)[13]。结果表明，自体或异体BM-MSC移植都未出现严重不良反应事件，且在术后随访的13个月里，均可提高患者的生活质量和活动能力，减少瘢痕面积，逆转心室重构，改善心功能；更为重要的发现是，异体BM-MSC移植并未导致免疫排斥，为异体MSC临床试验的开展奠定了基石和依据。而关于BM-MSC在非缺血性扩张型心肌病上的应用，通过导管心内膜注射，比较了自体及异体来源的BM-MSC对非缺血性扩张型心肌病的治疗效果[14]。在入组的37例患者中(自体BM-MSC组18例，异体BM-MSC组19例)，接受细胞治疗的30 d之内均无明显毒副反应；接受细胞治疗的12个月内，异体BM-MSC组出现毒副反应的概率为28.2%，在自体BM-MSC组为63.5%；在NYHA心力衰竭分级、射血分数、6分钟步行距离、MLHFQ评分、主要心血管不良事件发生率上，异体BM-MSC均显示出优于自体BM-MSC的治疗效果。在免疫学指标上，群体反应性抗体(calculated panel reactive antibodies，cPRA)检测发现只有一例患者(异体BM-MSC组)出现了高cPRA，但未导致免疫排斥。据统计，目前在Clinical trial.gov上登记的有19个BM-MSC治疗心力衰竭的临床试验(截至2017年7月)，而根据这些临床试验的结果，自体或异体BM-MSC移植治疗心力衰竭均不会导致严重不良反应。在安全性得到了保障的情况下，更大规模的临床试验有利于评估BM-MSC治疗心力衰竭的有效性。Afzal等[15]统计了2014年8月—2015年8月间的48个(共2 602例患者)关于骨髓细胞治疗缺血性心脏病的临床试验数据，肯定了骨髓细胞移植的良性获益。然而，由于BM-MSC并不具备分化为有功能的心肌细胞的能力，其发挥作用的方式主要是旁分泌作用，无法在功能上替换或增补在心肌梗死中损失的心肌细胞，一定程度上局限了其治疗效果。

4.3 内皮祖细胞

内皮祖细胞来源于BM-MNC，同时表达造血干细胞及内皮细胞的表面标志。典型的内皮祖细胞可通过CD34阳性分选富集为CD34+干细胞，分化成内皮细胞并促进新生血管形成。临床研究应用外周血动员的CD34+干细胞治疗顽固性心绞痛，6个月、1年及2年后的随访结果提示干细胞移植可显著降低心绞痛的发作频率，提高运动耐量，降低死亡率[16]。在缺血性心肌病及非缺血性扩张型心肌病的应用中，一些临床试验也肯定了CD34+干细胞移植的良性获益[17-18]。Quyyumi等[19]应用骨髓自体CD34+干细胞治疗ST段抬高型心肌梗死，该试验入组了共31例患者，结果提示冠状动脉内输注CD34+干细胞可提高心脏灌注，缩小梗死面积；在阳性结果的鼓舞下，他们紧接着又进行了更大规模的Ⅱ期临床试验(PreSERVE-AMI trial，入组患者共161例)，随访6个月后的数据提示干细胞移植对左室射血分数及梗死面积均无显著影响[20]。有学者认为在PreSERVE-AMI trial中得到的中性结果并不足以否定CD34+干细胞在心脏再生中的应用潜力和价值，一些影响疗效的因素例如细胞剂量、来源、时间、注射途径、入组患者的数量等，都有可能造成结果上的偏差，而在安全性得以保证的前提下，需通过更为严谨的试验设计和更大规模的临床试验重新评估CD34+干细胞的疗效[21]。

4.4 心脏干细胞

2003年，Anversa等首次报道了哺乳动物心肌内存在Ckit+的心脏干细胞(cardiac stem cell，CSC)。临床前研究发现CSC能持续进行心肌再生，可分化为心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，对心肌梗死所致的心力衰竭有明显治疗效果。2012年，Bolli的团队进行了首次CSC治疗缺血性心力衰竭的临床试验(SCIPIO trial)：该试验入组患者共30例，从患者右心耳提取Ckit+的CSC，在术后第3～5个月，将这些患者自体的CSCs通过冠状动脉内途径输注，4个月及12个月后心脏磁共振提示CSC有助于恢复梗死局部及整体心脏功能，心肌瘢痕面积减少[22]。该试验得到了令人振奋的结果，但在数据的完整性上却受到了质疑[23]，且目前尚缺乏直接充分的证据证明Ckit+细胞能分化为相当数量成熟的有功能的心肌细胞，利用CSC治疗心脏疾病仍有争议。另外，成人心脏中存在的CSC数量极少，在体外制备出相当数量细胞所需要的时间往往已经过了心肌梗死急性期，有可能影响CSC的疗效，也是自体CSC移植的瓶颈之一。基于这个考虑，2017年，Sanz-Ruiz等[24]启动了同种异体CSC治疗急性心肌梗死的随机双盲的Ⅰ/Ⅱ期临床试验(CAREMI trial)。与自体CSC相比，异体CSC可进行较大规模的生产，在细胞同质性、分化潜能、质量控制上易于把控，可制备为现成的细胞产品，在心肌梗死早期便可用于治疗。该试验计划入组55例大面积心肌梗死患者，将对异体CSC疗法的可行性、安全性、有效性进行评估，其研究结果可能会对CSC临床应用的发展提供重要依据。

4.5 心肌球源性细胞

心肌球细胞是心肌组织经贴壁生长后，再种植在多聚赖氨酸包被的培养皿中，形成具有三维结构的异质性细胞组合，从内向外大致可分为两层：中心是原始细胞层，表达Ckit，外层是间质细胞及分化细胞层，表达CD105、CD90等。心肌球源性细胞(cardiosphere-derived cell,CDC)是将心肌球细胞消化后铺于粘连蛋白包被的培养皿中继续培养形成的单层贴壁细胞，多表达CD105、CD166等干细胞标志。2012年，Makkar等[25]首次开展了冠状动脉内注射自体CDC治疗心肌梗死的研究(CADUCEUS trial)。该研究入组了31例患者，评估了3种不同剂量CDC经冠状动脉内移植的疗效，6个月后结果显示CDC移植可显著缩小梗死面积，增加有活性心肌和局部收缩期室壁厚度，但未能增加左室射血分数及改善患者的心功能分级[25]。2014年，他们更新了CDC移植1年后的随访数据，心脏超声及MRI显示CDC可进一步缩小梗死面积，改善梗死局部心功能，瘢痕面积的缩小与有活力的心肌增加成正比，但NYHA评分无差异[26]。京都医科大学Takehara等[27]在2012年AHA大会上发表的ALCADIA试验结果表明，给7例缺血性心肌病患者注入人自体CDC，可使患者平均最大氧耗量提高约1/3。另外一项利用同种异体CDC治疗心肌梗死的临床试验(ALLSTAR Trial)正在招募中，该试验在第一阶段计划入组14例患者，对CDC移植的安全性进行评估，第二阶段计划入组120例患者，对CDC移植的有效性进行评估。这些研究的成果都有可能为进一步研究CDC提供思路和方向[28]。值得注意的是CDC作为一群异质细胞，移植1年后未导致肿瘤，没有严重临床不良事件发生，值得进一步大规模的临床试验对其进行安全性及有效性的评估。

5 回顾及展望

虽然有临床研究报道了各种类型的干细胞移植可改善左室功能，减少心肌瘢痕，提高患者活动能力和生活质量等令人鼓舞的结果，但是这些结果仍存在较大的争议。2006年《新英格兰医学》杂志发表的两篇关于BM-MNC治疗心肌梗死的临床研究中，甚至出现了相反的结果：在REPAIR-AMI试验中，101例心肌梗死患者在骨髓干细胞移植后4个月，左室收缩功能有明显提高[29]；而在ASTAMI试验中，50例接受BM-MNC冠状动脉内注射的心肌梗死患者在移植6个月后并未观察到良性获益[30]。Seeger等[31]进一步分析指出在两个试验中采用的细胞分离及保存手段的差异，极大程度地影响了细胞的活性及功能，有可能是造成不同试验结果的重要因素。除了试验方案的不统一造成结果争议外，设计及统计方法上的不严谨和不科学亦引发了一些研究者关于干细胞领域“科学不端行为”的担忧。例如，Francis等[32]指出，在Strauer等发表的关于骨髓干细胞治疗心力衰竭的48篇论文中，在接受细胞治疗的患者数量、射血分数基线、细胞制备方法等存在大量的重复数据、错误和矛盾，其试验结论并不可信。

2016年，欧洲心脏病协会发表了意见书，就如何提高干细胞移植在缺血性心脏病及心力衰竭中的疗效提出了一系列建议[33]。未来的研究应指向如何精准控制细胞类型及作用机制，对比各种细胞或多种细胞联合的治疗效果。在临床评估的终结点上，应关注干细胞移植带来的功能改善能否对生活质量及生存率带来影响。

心力衰竭患者具有广泛的异质性，就像一个药物并非对所有患者有效，很难界定出一种干细胞适合所有的患者；而未来的干细胞治疗策略应侧重于更加个体化的治疗方案，对同一患者不同的疾病阶段选择最适合的干细胞类型、最佳剂量、最好输注途径和治疗频次。干细胞移植治疗心脏疾病的临床试验仍处于跌跌撞撞的起步阶段，但不能单独就某项研究的结果就判定其疗效，而是从结果中分析原因，总结经验，摸索前行，进行大规模、多中心、随机双盲的临床试验进一步探索。

[ 参 考 文 献 ]

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