陆扬帆， 黄 飚， 马 鑫

（1.江南大学药学院，江苏 无锡 214000；2.江苏省原子医学研究所，江苏 无锡 214063）

细胞膜瞬时受体电位通道5（transient receptor potential channel 5，TRPC5）是一类具有四聚体结构的非选择性阳离子通道，对Ca2+通透，参与细胞对渗透压反应的调控[1-2]。有研究结果表明，细胞膜微泡（extracellular vesicle，EV）是耐药乳腺肿瘤细胞受到药物刺激后特异性从乳腺肿瘤细胞表面通过细胞膜出芽方式大量生成的直径为100～500 nm的膜泡，该EV包裹化疗药物并携带TRPC5等关键蛋白进入血循环[3-5]，TRPC5或许可作为乳腺癌耐药诊断的标志物。本研究采用时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）建立了TRPC5 TRFIA。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

MUC1 抗体（ab70475）购自美国Abcam公司，Sulfo-SMCC、KLH、Sulfolink Resin 购自美国Pierce公司，福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，TRPC5多肽标准品由上海强耀生物科技有限公司合成。透析袋购自美国Viskase公司，PD-10柱购自美国BioRad公司，免疫磁珠购自苏州Beaver公司，Auto DELFIA 1235全自动TRFIA检测仪为美国PE - Wallac公司产品。

1.2 试剂的配制

1.2.1 TRPC5标准品溶液配制 将TRPC5标准品稀释成0 、5 、10 、20 、40 、50 、80 、100 、200、400、500 、800 和1 000 ng/mL系列浓度，稀释液为0.1 mol/L pH值7.5的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）。

1.2.2 β2缓冲液 分别称量9 g NaCl、5 g牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、20 μmol 二乙烯三胺五乙酸和0.5 g NaN3，定容至1 L，调节pH值为7.8。

1.2.3 洗脱缓冲液 分别称量9 g NaCl、3 g BSA、1 g NaN3，定容至1 L，调节pH值为7.8。

1.2.4 包被缓冲液 分别称量1.59 gNa2CO3、2.96 g NaHCO3，定容至1 L，调节pH值为9.6。

1.2.5 平衡缓冲液 分别称量0.9 g NaCl、1.59 g Na2CO3、2.96 g NaHCO3，定容至1 L，调节pH值为8.5。

1.3 方法

1.3.1 抗TRPC5多克隆抗体的制备 由上海强耀生物科技有限公司制备。抗TRPC5多克隆抗体TRPC5多肽是一种半抗原，没有免疫原性，故采用TRPC5与血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）耦联作为免疫抗原免疫新西兰大白兔。具体方法为：第1天，取抗原1 mL加入1 mL福氏完全佐剂，乳化，于大白兔颈背部皮下多点注射；……