殷惠梅，陆勇，施学智，余保军，吴明，陈荣琳，童华生

中暑是一种严重威胁军民生命的疾病，表现为中心体温超过40℃，而重症中暑常出现伴随弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)的多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。重症中暑病死率可达40%～70%，即使接受ICU治疗，其病死率仍高达63%[1]。重症中暑的发病机制目前仍不是十分清楚，近年研究发现基于血管内皮细胞损伤发生的微血栓和炎症网络反应是中暑多脏器功能损害产生的根本发病机制[2-3]。研究发现，炎症与血栓形成之间存在基于血管内皮为媒介的网络关系，血小板功能的激活在这种网络关系中发挥重要的调控作用[4]。病理状态下血小板激活通过表达、储存或合成释放大量的活性因子，调控基于血管内皮平台形成血栓和炎症反应[4-5]。早期临床发现，轻症中暑患者即出现血小板计数下降，患者体温升高达41℃以上时下降更明显[6]。我们团队通过病例回顾发现，重症中暑患者血小板计数下降提示死亡率增加，可作为预后预测指标[7-8]。然而，血小板是否参与重症中暑微血栓和炎症网络反应，同时其数量和功能相关的动态变化规律目前尚不清楚。本研究旨在观察重症中暑大鼠血小板数目和功能的动态变化规律，为进一步探讨血小板参与重症中暑的发病机制研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及动物 SPF级雄性SD大鼠30只，7～8周龄，体重265±5.0g，由南方医科大学动物实验中心提供，广州军区总医院动物实验中心饲养，大鼠不受限制获得合格的食物及水源。使用高温气候人工培养箱(宁波戴维)制备动物模型。流式细胞仪(BD LSRFortessaTM)，血液细胞分析仪(BC-3000，深圳迈瑞)，LBY-NL4A全自动血小板聚集仪(泰利康信)，Sonoclot全血凝血功能和血小板功能分析仪(Sienco Inc，USA SCP-2)，CD61-FITC和CD62P-PE抗体(Biolegend公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备及分组 涉及动物的所有实验方案获得了广州军区总医院动物喂养及使用委员会的支持，并通过实验动物伦理委员会批准。由于雌激素对热打击具有保护作用，本实验均采用雄性SD大鼠。30只雄性SD大鼠按随机数字表法分为常温(sham)组、重症中暑复温0h组(HS-0h)、重症中暑复温3h组(HS-3h)、重症中暑复温6h组(HS-6h)和重症中暑复温9h组(HS-9h)，每组6只。常温组将动物放置在环境温度22.0±0.5℃和湿度50%±5%的条件下，重症中暑组将大鼠置于长4m，宽3m，高2m的人工培养箱，温度39.5±0.2℃，相对湿度60%±5%，两组均撤去食物和水，每10min经直肠测中心体温(core temperature，Tc)，Tc达到43℃即判定为重症中暑发生[9]。重症中暑发生后，立即记录时间，并将大鼠移出人工培养箱，称重。常温条件下复温，并给予充足的食物和水。常温对照组动物不进行热暴露，常温放置相同时间后给予充足食物和水，其他实验步骤相同。

1.2.2 腹主动脉采血及血小板计数 10%水合氯醛(0.3ml/100g)进行腹腔注射麻醉，枸橼酸钠抗凝管腹主动脉采血，取50μl全血，用血液细胞分析仪检测血小板计数、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)。

1.2.3 血小板分离和纯度鉴定 取枸橼酸钠抗凝血3ml于无菌硅化玻璃管内，150×g离心8min获富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，小心吸取上3/4 PRP至新管中，加入2倍体积含Apyrase的枸橼酸-枸橼酸钠-葡萄糖保存液(acid-citrate-dextrose，ACD)(Apyrase:AC=1:100)，800×g离心10min，弃上清，血小板重悬液(Hepes-Tyrode buffer)调节血小板浓度为106～107/L。流式细胞仪检测血小板表面特异性标记物CD61-FITC(1:1000，25℃避光反应20min)进行血小板纯度鉴定。

1.2.4 血小板活化标记物CD62P表达检测 取上述血小板悬液，先后加入CD61-FITC(1:1000)和CD62P-PE(1:500)，25℃避光反应20min，流式细胞仪检测双阳性血小板比率。

1.2.5 血小板最大聚集率检测 采用血液细胞分析仪检测PRP浓度，吸取PRP，剩余血液1000×g离心10min，上清为乏血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，用PPP调整PRP浓度为400～500×109/L，取300μl血小板悬液和PPP加入全自动血小板聚集仪，诱导剂为二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，浓度为150μmol/L，配套有磁珠和试管。使用比色法检测血小板最大聚集率。

1.2.6 血小板功能(PF)检测 取新鲜未抗凝动脉血500μl加入Sonoclot全血凝血和血小板功能分析仪的试杯中，通过体外激活内源性凝血途径来模拟凝血全过程检测血小板PF值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料采用±s表示，多组间比较采用Oneway ANOVA分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 热打击后大鼠体重和中心体温变化 大鼠达重症中暑时间和相关生理参数变化见表1。热打击前sham组和重症中暑组Tc为36.7±0.2℃，采用Tc 43℃作为重症中暑标准，重症中暑组大鼠Tc增加6.3±0.2℃，sham组大鼠Tc(36.7±0.2℃)无变化。大鼠重症中暑发生时间为172.5±9.0min。热打击前大鼠体重sham组(266.5±2.4g)和重症中暑组(266.7±2.7g)差异无统计学意义。重症中暑发生时sham组大鼠体重261.0±2.5g，减轻5.5±1.2g，重症中暑组大鼠体重238.5±4.2g，减轻28.3±3.7g。与sham组比较，重症中暑组大鼠体重变化和Tc变化有统计学意义(P＜0.001)。

2.2 血小板分离纯度鉴定 采用血小板特异性抗体CD61-FITC检测分离出来的血小板纯度，为94%±2%(图1)，提示本实验采用的血小板分离方法所得血小板纯度较高，达到实验要求。

2.3 重症中暑血小板数量动态变化 与sham组[(814.3±17.8)×109/L]比较，复温0h组[(625.7±17.8)×109/L，P＜0.01]和3h组[(521.3±11.9)×109/L，P＜0.001]呈现下降趋势，复温3h组较复温0h组血小板计数下降(P＜0.05)，提示重症中暑早期即出现血小板计数下降，且呈时间依赖性。与复温6h组[(417.3±6.1)×109/L]比较，复温9h组[(259.3±124.1)×109/L，P＜0.01]继续下降，提示重症中暑晚期血小板计数继续呈时间依赖性下降(图2)。

2.4 重症中暑血小板CD62P表达动态变化 Sham组血小板CD62P-PE阳性率为1.7%±0.3%，随复温时间延长，各组活化率逐渐上升。与sham组比较，复温0h组(4.2%±0.3%，P＜0.05)，复温3h组(6.7%±0.2%，P＜0.05)，复温6h组(9.6%±1.7%，P＜0.05)和复温9h组(19.1%±3.2%，P＜0.001)血小板活化率均上升。血小板活化率的升高呈时间依赖性(图3)。

2.5 重症中暑血小板最大聚集率动态变化 正常大鼠血小板最大聚集率为73.5%±2.0%。从重症中暑早期即开始出现血小板最大聚集率下降，至复温9h降至最低，血小板最大聚集率随复温时间延长进行性下降(图4)。

表1 重症中暑大鼠中心体温和体重变化Tab.1 Changes of the core temperature and body weight of severe heatstroke rats (±s)

表1 重症中暑大鼠中心体温和体重变化Tab.1 Changes of the core temperature and body weight of severe heatstroke rats (±s)

BW. Body weight; Tc. Core temperature

Item Sham group(n=6)HS group(n=24) P value BW pre-heating (g) 266.5±2.4 266.7±2.7 BW post-heating (g) 261.0±2.5 238.5±4.2 BW change (g) 5.5±1.2 28.3±3.7 ＜0.001 Heat exposure time (min) 0 172.5±9.0 Tc pre-heating (℃) 36.7±0.2 36.7±0.2 Tc post-heating (℃) 36.7±0.2 43 Tc change (℃) 0 6.3±0.2 ＜0.001

图1 血小板纯度检测Fig.1 Detection of platelet purity

图2 各组大鼠血小板计数检测Fig.2 Platelet counts of rats in each group

图3 流式细胞仪检测各组大鼠血小板CD62P表达水平Fig.3 CD62P expression levels in platelets of rats in each group detected by flow cytometry

图4 各组大鼠血小板最大聚集率检测Fig.4 The maximum aggregation rate of platelets in each group of rats

2.6 重症中暑血小板功能动态变化 Sham组PF值为3.7±0.6，HS-0h组为3.0±0.3，HS-3h组为2.8±0.7，HS-6h组为2.3±0.7，HS-9h组为1.3±0.3。组间比较可见血小板功能呈时间依赖性下降(P＜0.001，图5)。

图5 各组大鼠血小板功能检测Fig.5 Detection of platelet function of rats in each group

3 讨 论

血小板减少是重症中暑的常见现象，有研究认为血小板以积极主动而非被动黏附至血管内皮的方式参与了重症中暑微血栓的形成[10]。我们通过对176例重症中暑进行回顾性分析发现，重症中暑早期血小板计数下降提示病死率增加，可作为预后预测指标[8]，提示血小板可能参与了重症中暑的发病机制。但目前对重症中暑患者血小板数量的动态变化规律还不清楚。本研究观察重症中暑大鼠血小板动态变化规律，发现血小板计数下降在早期即出现，且呈时间依赖性，分析机制可能如下：①高热损伤血小板：重症中暑患者中心体温达40℃以上，高热可直接损伤血小板，触发血小板凋亡机制，包括线粒体膜电位下降，磷脂酰丝氨酸暴露和Caspase-3依赖性蛋白的分裂，以及血小板糖蛋白Iba的脱落[11]；②炎症介质损伤血小板：重症中暑存在严重且广泛的组织细胞坏死，释放多种炎症介质[9,12]，大量炎症介质诱导血小板发生凋亡和坏死[9,13]，造成血小板数目的减少。

凝血功能紊乱是重症中暑的突出特点[14]。血小板数量和功能在凝血反应中起着重要作用[15]。重症中暑患者血小板数目出现下降，血小板功能的动态变化是否参与重症中暑还不是十分清楚。CD62P称为血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白或P-选择素，属于细胞黏附分子中的选择素家族，正常情况下不表达或低水平表达，在血小板活化时与血小板表面的质膜融合，显著表达于血小板膜上[16]，为血小板活化的特异性标志物[17]。CD62P介导血小板与内皮细胞及多种血细胞及血小板之间的黏附，参与血小板聚集、血栓形成、炎症和免疫反应，激活中性粒细胞，释放血管活性物质、氧化代谢产物，促使纤维蛋白原沉积等生物学效应发生，使血管内皮的损害加重。我们首先研究重症中暑血小板CD62P的变化。研究发现，重症中暑发生后血小板CD62P的比例持续上升，在重症中暑晚期达到最高，表明重症中暑过程中血小板持续受到损伤性刺激，但是中暑血小板具体功能的动态变化还有待研究。血小板聚集性是血小板的重要功能之一，研究显示，体外热打击血小板，温度达43～44℃时血小板聚集性不可逆性增高，温度达45℃时聚集性受抑制[18]。本研究发现，在重症中暑发生时血小板最大聚集率即出现下降，随复温时间延长，最大聚集率进一步下降，在9h达最低。表明重症中暑血小板的聚集功能受损，其具体机制如何还有待进一步研究。

血小板功能PF值主要反映血小板的质量，是目前唯一能对血小板功能进行准确定量的检测，与血小板计数相比能更好地反映血小板凝血活性，结合Sonoclot分析仪的其他指标可综合评价患者出凝血状态，能够准确指导治疗[19]。为进一步研究重症中暑对血小板止血活性的影响，我们检测了重症中暑大鼠血小板功能PF的动态变化。与血小板最大聚集率动态趋势一致，我们研究发现重症中暑后血小板功能PF值随复温时间延长持续下降，原因可能是：在早期，热打击引起的炎症直接损伤血管内皮细胞，暴露出胶原，释放血小板活化因子(plateletactivating factor，PAF)使血小板黏附、活化和聚集，在微循环中形成大量的微血栓，而微血栓形成又会消耗大量的血小板，此时血小板功能可能基本正常。随着病程进一步发展，凝血失控，凝血因子及血小板数量进一步减少，血小板功能障碍[20-21]。

综上所述，重症中暑大鼠早期即可发生血小板数量减少和功能的下降及活化现象。血小板数量和功能性病理改变基于何种机制发生，同时是否参与且以何种机制参与重症中暑的发病机制是下一步的研究重点。

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