沈馨，王艳，代凯文，尚雪娇，董蕴，郭壮，*

（1.湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053；2.当阳市妇幼保健院 检验科，湖北宜昌444100；3.当阳市食品药品监督管理局，湖北宜昌444100）

辣椒酱是以破碎的鲜辣椒或干辣椒为原料，经发酵或非发酵加工制作而成的一种调味品，因具有促进食欲和健脾开胃的功效而深受消费者喜爱[1]。传统的辣椒酱主要依靠辣椒自带或环境中的乳酸菌自然发酵而成，制作工艺相对简单，发酵周期也较长[2]。众所周知，传统发酵食品制作环境相对开放，基质中微生物的多样性亦相对较高，不仅蕴含对产品品质形成具有积极意义或具有潜在益生特性的菌株，亦可能含有一些致病菌或条件致病菌[3]。然而令人遗憾的是，目前关于辣椒酱细菌微生物多样性研究的报道尚少。

近年来以Miseq为代表的第二代高通量测序技术，采用宏基因组学的研究策略，不仅全面揭示了传统发酵食品中微生物的群落结构，同时亦实现了微生物多样性与产品品质的关联分析[4]，目前在葡萄酒[5]、腊肠[6]、泡菜[7]和窖泥[8]等微生物多样性研究中有了广泛的应用，这为解析辣椒酱中细菌微生物的多样性提供了新的技术手段。作为产品品质的重要组成部分，滋味品质直接决定了消费者对辣椒酱产品的喜好程度。相对于感官鉴评方法，电子舌技术实现了酱类制品中酸、苦、涩、鲜和咸5个基本味及苦、涩和鲜味3个基本味回味的数字化评价，具有对试验人员专业技能要求低且受外界影响小的优点[9]。

在采用Miseq高通量测序技术对辣椒酱中细菌微生物多样性进行揭示的基础上，本研究进一步使用电子舌这一仿生设备对产品的滋味品质进行了评价，同时探讨了核心细菌类群对辣椒酱品质的影响，以期为后续辣椒酱中优势菌株的分离及产品的产业化生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品采集：从湖北省当阳市草埠湖镇和玉泉办事处的6个农户家中，各采集1个自制辣椒酱样品，每个样品分别采集200 g左右，置于含有冰袋的采样箱中进行DNA提取。

5×TransStartTM FastPfu Buffer、dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase：北京全式金生物技术有限公司；E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒：美国OMEGA公司；阴离子溶液、阳离子溶液、味觉标准溶液、内部溶液和参比溶液：日本Insent公司。

1.2 仪器与设备

5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度计：美国Nano Drop公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；UVPCDS8000凝胶成像分析系统：美国BIO-R AD公司；vetiri梯度基因扩增仪：美国AB公司；Miseq高通量测序平台：美国Illumina公司；R 920机架式服务器：美国DELL公司；SA 402B电子舌（配备 AAE、CT0、CA0、AE1和 C00测试传感器）：日本Insent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取

取10 g辣椒酱加入40 mL蒸馏水，300 r/min离心10 min后取上清，继而10 000 r/min离心10 min后取沉淀，采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒进行微生物宏基因组DNA提取。

1.3.2 细菌16S rR NA序列V4-V5区扩增及扩增体系

DNA模板10 ng，5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL，5U/μLDNA 聚合酶0.4μL，2.5mmol/LdNTPsmix 2μL，5×PCR缓冲液4μL，体系用 ddH2O 补充至 20 μL。其中：正向引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）， 反 向 引 物 为 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），在正向引物前端加入7个核苷酸标签（barcode），以便进行生物信息学分析时将序列划分到各个样品。扩增条件：95℃变性3 min；95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，35个循环；72℃延伸10 min。

1.3.3 高通量测序及序列质控

PCR产物置于干冰中冷链寄往上海美吉生物医药科技有限公司，使用Miseq高通量测序平台进行测序。数据下机后，首先将双端序列拼接成一条序列，继而根据barcode信息将拼接好的序列划分到各样品并进行序列方向校正，然后去除序列中的barcode和引物，最后将6个样品的序列归并为1个fna文件进行后续生物信息学分析。值得一提的是，若在拼接过程中成对序列的重叠区小于10 bp或最大错配比率大于0.2、有barcode碱基错配或引物碱基错配数大于2 bp及切除barcode和引物后序列长度小于50 bp，则相对应的序列均予以剔除。

1.3.4 生物信息学分析

将质控后的序列文件导入QIIME（v1.7.0）[10]进行分析，首先调用PyNAST[11]软件将所有序列对齐；其次采用UCLUST算法[12]进行序列划分并建立分类操作单元（Operational taxonomic units，OTU），若某一 OTU 在所有样品中均存在则将其定义为核心OTU；然后使用ChimeraSlayer[13]进行嵌合体去除；继而挑选OTU中的代表性序列同时使用R DP（ribosomal database project，R elease 11.5）[14]和 Greengenes（R elease 13.8）[15]数据库明确OTU分类学地位，若某一门或属在所有样品中均存在，则将其定义为核心门或属；接着使用FastTree软件[16]绘制代表性序列系统发育进化树，并在此基础上计算α多样性指数—香农指数（Shannon index）、超1指数（Chao1 index）和发现物种数，进而绘制稀疏曲线图和香农指数曲线。

1.3.5 核酸登录号

本研究中所有Miseq高通量测序数据均已提交至MG-RAST数据库，ID号为mgp336604。

1.3.6 辣椒酱样品的滋味品质分析

取20.0 g辣椒酱用180 mL蒸馏水4℃浸泡过夜后，3 000 r/min离心10 min后取上清备用。传感器活化、清洗后，首先在参比溶液中测得电势值Vr；其次在样品中测得电势 Vs，C00、AE1、CA0、CT0 和 AAE 5 个传感器对应的Vs-Vr值即为样品酸、苦、涩、咸和鲜味等5个基本味的相对强度值；再次洗涤后，C00、AE1和AAE 3个传感器分别在参比溶液中测得电势Vr’，Vr’-Vr值为辣椒酱后味A（涩的回味）、后味B（苦的回味）和丰度（鲜的回味）的相对强度值。

1.3.7 数据统计学分析

使用皮尔森相关性分析法（Pearson correlation analysis）计算核心细菌类群和各滋味指标相对强度之间的相关系数，并选取相关系数绝对值大于0.5的指标，使用Cytoscape软件（v3.5.1）进行网络图绘制。采用Mega5.0软件绘制核心OTU系统发育树；其他图均由Origin 8.6软件绘制。进行滋味品质分析时，每个辣椒酱样品重复测定4次，选后3次纳入数据分析。

2 结果与分析

2.1 序列丰富度和多样性分析

纳入本研究的6个辣椒酱样品16s rRNA V4-V5区序列测序情况及各分类地位数量如表1所示。

由表1可知，本研究共有225 830条高质量16srRNA序列通过质控，平均每个样品产出37 638条序列。本研究分别采用100%和97.0%相似性进行两步UCLUST划分，共得到74 179条代表性序列和4 709个OTU，在采用ChimeraSlayer进行嵌合体检查时，去除了11个OTU，因而每个样品平均有1 398个OTU。由表1亦可知，在6个辣椒酱样品中LJ3的Chao 1指数最高同时Shannon指数最大，由此可见，LJ3样品中细菌微生物的丰富度最大多样性亦最高。本研究进一步绘制了随着测序深度的加深，发现物种数指数和Shannon指数的变化曲线，进而对本研究的测序深度是否满足后续生物信息学分析要求进行了评估，其结果如图1所示。

表1 样品16s rRNA测序情况及各分类地位数量Table 1 16s rRNA read counts and number of identifiable units at different taxonomical levels

图1 稀疏曲线和香农指数曲线图Fig.1 Rarefaction analysis and shannon diversity estimates of the high throughput sequencing

由图1（A）可知，即使达到本研究单个样品的最大测序深度43 546条，稀疏曲线亦未进入平台期，这说明随着测序深度的增大，辣椒酱中依旧会有新的细菌种系型被发现。然而由图1（B）可知，在测序深度达到2 000条左右时，所有的香农指数曲线已经进入了平台期，这说明随着测序量的增加虽然新的种系型会被发现，但细菌微生物的多样性不会再随之发生变化了，因而本研究的测序深度是可以满足后续分析要求的。

2.2 基于各分类学地位辣椒酱细菌相对含量的分析

在对序列丰富度和多样性分析的基础上，本研究进一步对质控合格后的序列进行了鉴定，所有的序列鉴定为19个门、46个纲、65个目、160个科和387个属，其中仅有0.056%和7.70%的序列不能鉴定到门和属水平。因本研究仅采集了6个辣椒酱样品，存在样本量不足的缺陷，为了弥补这一不足同时减少样品间差异性对分析结果造成的影响，本研究仅对平均相对含量大于1.0%的核心细菌门、属和OTU进行了分析。辣椒酱样品中相对含量大于1.0%的核心细菌门构成如图2所示。

图2 辣椒酱样品中相对含量大于1.0%的核心细菌门Fig.2 Comparative analysis on the content of core bacterial phyla with relative abundance more than 1.0%in chilli sauce samples

由图2可知，在门水平上，辣椒酱样品中的细菌类群主要隶属于硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），其平均相对含量分别为66.73%、22.79%和9.75%。辣椒酱样品中相对含量大于1.0%的核心细菌属构成如图3所示。

由图3可知，辣椒酱中平均相对含量大于1.0%的核心细菌属包括隶属于硬壁菌门（Firmicutes）的芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、梭菌（Clostridium）、魏斯氏菌（Weissella）和乳酸杆菌（Lactobacillus），其平均相对含量分别为37.62%、20.66%、2.5%、1.37%和1.09%；隶属于变形菌门（Proteobacteria）的克雷白氏杆菌（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）和布丘氏菌属（Buttiauxella），其平均相对含量分别为6.87%、1.18%和1.08%；以及隶属于放线菌门（Actinobacteria）的棒状杆菌（Corynebacterium），其平均相对含量为5.96%。

图3 辣椒酱样品中相对含量大于1.0%的核心细菌属Fig.3 Comparative analysis on the content of core bacterial genera with relative abundance more than1.0%in chilli sauce samples

辣椒酱样品中含有隶属于乳杆菌目（Lactobacillales）的魏斯氏菌（Weissella）和乳酸杆菌（Lactobacillus），其平均含量分别为1.37%和1.09%。两者均为乳酸菌，通过产生有机酸，同时生成醇、醛和酮等多种风味物质，对发酵食品的滋味和风味品质具有积极的影响[17]。此外，本研究发现辣椒酱中存在37.62%的芽孢杆菌（Bacillus），究其原因可能与辣椒酱中食盐含量较高有关而芽孢杆菌具有较好的耐受性。值得一提的是，芽孢杆菌亦为细菌型豆豉中的优势菌，对豆豉风味品质的形成具有积极的意义[18]。

从农户家中采集的辣椒酱样品含有大量的克雷白氏杆菌（Klebsiella）、肠杆菌（Enterobacter）、葡萄球菌（Staphylococcus）和梭菌（Clostridium），其累计平均含量达到了细菌序列总数的30.08%。隶属于上述4个属的部分细菌种为条件致病菌，例如作为克雷白氏杆菌（Klebsiella）中常见的种肺炎克雷伯氏菌（K.peneumoniae）是重要的医源性感染菌之一[19]，隶属于肠杆菌属（Enterobacter）的阪崎肠杆菌（E.Sakazakii）能引起新生儿脑膜炎和败血症[20]，葡萄球菌（Staphylococcus）中的金黄色葡萄球菌（S.aureus）是人类化脓感染中最常见的病原菌[21]，梭菌属（Clostridium）中的致病性菌种可引起梭菌病这一人畜共患病[22]。由此可见，农家自制的辣椒酱样品中存在大量的条件致病菌，具有一定的食品安全隐患，其与产品制作环境开放且发酵周期长有关，因而在后续研究中从辣椒酱中分离、纯化、鉴定并筛选出具有优良发酵特性的优势菌株用于产品的生产，无论是对实现辣椒酱的产业化生产，还是减少食品安全隐患均具有积极的意义。本研究亦发现辣椒酱中存在1%左右的布丘氏菌属细菌，有报道指出隶属于该菌属的细菌为草鱼肉冷藏过程中的优势腐败菌[23]。值得一提的是，本研究发现辣椒酱样品中存在5.96%的隶属于棒状杆菌（Corynebacterium）的细菌，该属中的谷氨酸棒状杆菌（C.glutamicum）可在微生物发酵工程生产谷氨酸来制取味精[24]，而同样是隶属该属的白喉杆菌（C.diphtheriae）却是引起小儿白喉的病原菌[25]。令人遗憾的是，由于Miseq测序长度较短，无法完成16s rRNA全长测序，因而仅能将序列鉴定到属水平，在后续研究中采用单分子实时（single molecule real-time，SMRT）测序技术[26]或使用选择性培养基对棒状杆菌属的细菌进行分离鉴定，进而进一步在种水平上对细菌的种系型进行确定是极为必要的。

本研究进一步统计了4 698个OTU在6个辣椒酱样品中出现的次数，其结果如图4所示。

由图4可知，虽然核心OTU有271个，仅占OTU总数的5.77%，但其包含了196 955条序列，占所有质控后合格序列数的87.21%。此外，在6个样品中出现5、4、3、2 次的 OTU 各有 176、183、279、522 个，分别占OTU总数的6.23%、1.96%、1.38%和1.34%，4类OTU共包含24 634条序列，占所有质控后合格序列数的10.91%。虽然在6个样品中仅出现1次的OTU多达4 241个，占到OTU总数的69.54%，但其仅包含4 241条序列，平均每个OTU包含1.3条序列。由此可见，在OTU水平上，6个辣椒酱样品亦共有大量的细菌类群，其累计平均相对含量达到87%以上。本研究进一步对271个核心OTU进行了分析，发现有14个OTU的平均相对含量大于1.0%，相对含量大于1.0%核心OTU在各辣椒酱样品中相对含量的热图如图5所示。

图4 OTU在6个样品中出现次数统计Fig.4 Distribution of OTU as a function of their prevalence in 6 samples

图5 平均相对含量大于1.0%核心OTU在各辣椒酱样品中相对含量的热图Fig.5 Heat map of the contents of core OTUs among chilli sauce samples

由图5可知，本研究甄别出的14个核心OTU中3个隶属于葡萄球菌（Staphylococcus），5个隶属于芽孢杆菌（Bacillus）、2个隶属于克雷白氏杆菌（Klebsiella），各有1个隶属于梭菌（Clostridium）、棒状杆菌（Corynebacterium）、布丘氏菌属（Buttiauxella）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。此外，14个核心OTU累计平均相对含量达到55.29%，尤其是OTU1218（隶属于芽孢杆菌）、OTU597（隶属于葡萄球菌）、OTU1350（隶属于芽孢杆菌）和OTU2747（隶属于葡萄球菌），其平均含量含量为11.41%、9.49%、7.03%和6.25%。值得一提的是，各核心OTU在样品中的分布也存在较大的差异，例如OTU1350（隶属于芽孢杆菌）在LJ4和LJ5中的相对含量分别为18.16%和20.21%，但在其他样品中的相对含量均小于2.0%，OTU64（隶属于芽孢杆菌）在LJ1中的相对含量达到15.40%，但在其他5个样品中的相对含量均小于3.0%。由此可见，虽然存在于所有样品中，但核心OTU在各样品中的平均含量差异是较大的。平均相对含量大于1.0%核心OTU相关性的热图如图6所示。

图6 平均相对含量大于1.0%核心OTU相关性的热图Fig.6 Heat map of correlation among the core OTUs with relative abundance more than 1.0%

由图6可知，OTU2747（隶属于葡萄球菌属）与OTU1568（隶属于葡萄球菌属）呈显著正相关（R=0.905，P<0.05）；OTU597（隶属于葡萄球菌属）与 OTU921（隶属于肠杆菌科）呈显著正相关（R=0.892，P<0.05）；OTU1199（隶属于克雷白氏杆菌属）与OTU790（隶属于克雷白氏杆菌属）呈极显著正相关（R=0.979，P<0.001），与OTU1652（隶属于梭菌属）呈显著正相关（R=0.818，P<0.001）；OTU64（隶属于芽孢杆菌属）与 OTU1652（隶属于梭菌属）呈极显著正相关（R=0.989，P<0.001）；OTU2087（隶属于芽孢杆菌属）与 OTU1350（隶属于芽孢杆菌属）呈非常显著正相关（R=0.931，P<0.01）；OTU3254（隶属于芽孢杆菌属）与 OTU1218（隶属于芽孢杆菌属）呈极显著正相关（R=0.977，P<0.001）。由此可见，葡萄球菌可以促使芽孢杆菌和一些肠杆菌科细菌的增长。

2.3 辣椒酱核心细菌类群与滋味品质的关联性分析

在对6个辣椒酱样品核心细菌类群进行解析的基础上，本研究进一步对样品滋味品质的差异性进行了评价，同时通过构建核心细菌类群与滋味品质相关性的网络图，探讨了核心细菌类群对鲊广椒滋味品质的影响。辣椒酱各滋味指标相对强度值的箱形图如图7所示。

图7 辣椒酱各滋味指标相对强度值的箱形图Fig.7 The box plot of relative intensity of each taste index in chilli sauce samples

由图7可知，纳入本研究的辣椒酱样品在酸味、咸味、涩味和鲜味上的差异较大，其极差值分别为18.85、13.41、7.56和6.22，而在后味A（涩的后味）和后味B（苦的回味）指标上的差异性较小，极差值仅为0.16和2.02。辣椒酱样品在酸味上差异比较大的原因可能与样品中含有2.46%的乳酸菌有关，而鲜味差异比较大的原因可能与样品中含有棒状杆菌有关，该属的部分细菌可以产生谷氨酸等鲜味呈味物质。本研究进一步对辣椒酱核心细菌类群和滋味物质的相关性进行了计算，其结果如图8所示。

图8 辣椒酱核心细菌类群和滋味指标相关性的网络图Fig.8 Correlation network diagram of core bacterial microflora and taste indexes among chilli sauce samples

由图8可知，相对于乳酸杆菌（Lactobacillus）、梭菌（Clostridium）、葡萄球菌（Staphylococcus）和肠杆菌属（Enterobacter）的核心细菌类群，芽孢杆菌（Bacillus）、魏斯氏菌（Weissella）、克雷白氏杆菌（Klebsiella）、布丘氏菌属（Buttiauxella）和棒状杆菌（Corynebacterium）对辣椒酱的滋味品质影响可能相对更大。由图8亦可知，棒状杆菌（Corynebacterium）、克雷白氏杆菌（Klebsiella）和布丘氏菌属（Buttiauxella）的相对含量与辣椒酱的鲜味呈现正相关。本研究亦发现芽孢杆菌（Bacillus）与酸味呈现正相关，这可能与部分芽孢杆菌具有产酸特性有关[27]，而乳酸杆菌（Lactobacillus）与酸味的相关性较弱。

3 结论

辣椒酱中的核心细菌类群主要由隶属于硬壁菌门（Firmicutes）的芽孢杆菌（Bacillus）和葡萄球菌（Staphylococcus）构成，酸味是辣椒酱样品间差异最大的滋味指标，微生物构成对辣椒酱滋味品质的形成具有较大的影响。

[1]郭琳,孟梦,郭淼,等.接种乳酸菌改善辣椒酱风味的研究[J].中国调味品,2016,41(5):1-7

[2]白露露,胡文忠,姜爱丽,等.辣椒加工工艺及其设备的应用现状[J].食品工业科技,2014,35(15):369-372

[3]Gracias K S,Mckillip J L.A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food[J].Canadian journal of microbiology,2004,50(11):883-890

[4]Cocolin L,Alessandria V,Dolci P,et al.Culture independent methods to assess the diversity and dynamics of microbiota during food fermentation[J].International journal of food microbiology,2013,167(1):29-43

[5]Boynton P J,GREIG D.Fungal diversity and ecosystem function data from wine fermentation vats and microcosms[J].Data in brief,2016,8(12):225-229

[6]Justyna P,Annalisa R,Vincenza P,et al.Bacterial diversity in typical Italian salami at different ripening stages as revealed by highthroughput of 16s rDNA amplicons[J].Food microbiology,2015,46(4):342-356

[7]Yang H,Wu H,Gao L,et al.Effects of Lactobacillus curvatus and Leuconostoc mesenteroides on Suan Cai Fermentation in Northeast China[J].Journal of microbiology and biotechnology,2016,26(12):2148-2158

[8]Hu X,Du H,Ren C,et al.Illuminating anaerobic microbial community and cooccurrence patterns across a quality gradient in Chinese liquor fermentation pit muds[J].Applied and environmental microbiology,2016,82(8):2506-2515

[9]Winquist F,Wide P,Lundström I.An electronic tongue based on voltammetry[J].Analytica chimica acta,1997,357(1):21-31

[10]Caporaso J G,Kuczynski J,Stombaugh J,et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nature methods,2010,7(5):335-336

[11]Caporaso J G,Bittinger K,Bushman F D,et al.PyNAST:a flexible tool for aligning sequences to a template alignment[J].Bioinformatics,2010,26(2):266-267

[12]Edgar R C.Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J].Bioinformatics,2010,26(19):2460-2461

[13]Haas B J,Gevers D,EARL A M,et al.Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons[J].Genome research,2011,21(3):494-504

[14]Cole J R,Chai B,Farris R J,et al.The ribosomal database project(RDP-II):introducing myRDP space and quality controlled public data[J].Nucleic acids research,2007,35(1):169-172

[15]Desantis T Z,Hugenholtz P,Larsen N,et al.Greengenes,a chimerachecked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,2006,72(7):5069-5072

[16]Price M N,Dehal P S,Arkin A P.Fasttree:computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix[J].Molecular biology and evolution,2009,26(7):1641-1650

[17]刘毕琴,芦夏霏,柳陈坚,等.乳酸菌贡献细菌型豆豉风味的研究进展[J].核农学报,2016,30(1):136-144

[18]苏悟,郑小芬,徐睿烜,等.1种细菌型豆豉自然发酵过程中生物胺的变化[J].食品与发酵工业,2014,40(7):40-45

[19]Tong S Y C,Davis J S,Eichenberger E,et al.Staphylococcus aureus infections:epidemiology,pathophysiology,clinical manifestations,and management[J].Clinical microbiology reviews,2015,28(3):603-661

[20]Hu X,Dou W,Fu L,et al.A disposable immunosensor for Enterobacter sakazakii based on an electrochemically reduced graphene oxide-modified electrode[J].Analytical biochemistry,2013,434(2):218-220

[21]陈文秀,姜旋,马晓燕,等.实时荧光环介导等温扩增技术检测乳粉中的肺炎克雷伯氏菌[J].食品科学,2014,35(20):192-197

[22]Hosie B D.Clostridial disease in domestic and wild animals[J].Veterinary record,2017,180(14):360-360

[23]王发祥,王满生,刘永乐,等.低温贮藏下草鱼肉优势腐败菌鉴定及其消长规律[J].食品与发酵工业,2012,38(2):66-68

[24]张成林,龙辉,温冰,等.双底物指数流加和双阶段溶氧控制对谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的影响[J].食品与发酵工业,2014,40(4):1-6

[25]Efstratiou A,George R C.Laboratory guidelines for the diagnosis of infections caused by Corynebacterium diphtheriae and C ulcerans[J].Communicable disease and public health,1999,2(4):250-257

[26]Mccarthy A.Third generation DNA sequencing:pacific biosciences'single molecule real time technology[J].Chemistry&biology,2010,17(7):675-676

[27]于华,黄丹,陈卓,等.四川麸醋醋醅中产酸芽孢杆菌的分离及发酵特性研究[J].中国食品添加剂,2017,24(1):83-90