白雪，宁宏

（中国医科大学附属第一医院眼科，沈阳 110001）

后发性白内障（posterior capsule opacification，PCO）是晶体破损或晶体摘除术后，其残余的皮质或上皮细胞在后囊膜上发生的病理变化。研究［1］表明，PCO的发生是由众多生长因子及细胞凋亡共同作用的。所以，现阶段的重心是如何在促进人晶状体上皮细胞 （human lens epithelial cells，HLECs） 凋亡的同时抑制其增殖。作为新型的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 （mammal target of rapamycin，mTOR） 抑制剂PP242，可以影响多种肿瘤细胞的发展［2］。既往的研究［3］已经证明，PP242对HLECs的生长有抑制作用，同时有减弱促凋亡蛋白Bcl-2的作用。本研究用不同浓度PP242处理HLECs，观察PP242对其凋亡的影响及凋亡蛋白Bax的变化，揭示 PP242对PCO的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

PP242 （美国Sigma公司） ，人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞株 （中国北京中国科学院肿瘤研究所） ，胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基 （美国Hyclone公司） ，Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞检测试剂盒 （中国碧云天公司） ，细胞培养耗材 （美国Corning公司） ，兔抗人β-actin单克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔lgG二抗 （美国Santa Cruz 公司） ，兔抗人Bax抗体 （美国Abcam 公司） ，β-actin mRNA引物、Bax引物 （中国上海生工生物工程有限公司） 。

1.2 细胞分组

对照组用含浓度为0 nmol/L PP242的培养基培养细胞；实验组分别用含250、500、750、1 000 nmol/L PP242的培养基培养细胞，培养时间均为48 h。

1.3 Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率

用0.25%胰蛋白酶消化细胞，将制备的单细胞悬液加入15 mL离心管中，4 ℃的PBS洗2次。用250 μ L结合缓冲液将细胞悬浮，调整细胞数至1×106/mL，取100 μ L放入检测管中，加5 μ L Annexin V/-FITC和10 μ L PI溶液，混匀、室温避光、孵育15 min。加入400 μ L PBS，上流式细胞仪检测。

1.4 Western blotting 检测经 PP242处理后SRA01/04的Bax蛋白表达情况

将各实验组细胞低温加入裂解液，离心（13 000 r/min、4 ℃） 15 min，测蛋白浓度。每孔取50 μ L样品行10%SDS-PAGE电泳。转膜，封闭2 h，4 ℃封一抗 （兔抗人Bax单克隆抗体） 12 h。TBST洗15 min，3次。室温封二抗 （辣根酶标记山羊抗小鼠抗体） 2 h，TBST洗15 min，3次。用 ECL化学发光法曝光胶片。

1.5 实时定量PCR检测经PP242处理后SRA01/04的Bax mRNA表达情况

用异硫氢酸胍-酚-氯仿法提取总RNA，测A260nm和A280nm，并计算RNA浓度。取浓度为500 ng/μ L RNA 2 μ L，逆转录cDNA，行实时定量PCR。β-actin 上游引物序列：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’，下游引物 序 列：5’-AAAGGG TGTAACGCAACTAA-3’；Bax上游引物序列：5’-CCGATTCATCTACCCTGCTG-3’，下游引物序列：5’- TGAGCAATTCCAGAGGCAGT-3’。取2 μ L cDNA模板，设3个复孔，两步法扩增目的基因，40个循环行PCR反应。计算各组 β-actin和Bax mRNA的相对表达量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，计量资料用x-±s表示，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Annexin V/PI双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

如图1所示，左下区为Annexin V-FITC和PI均阴性，表示活细胞；左上区为PI阳性，表示死亡细胞；右下区为Annexin V-FITC阳性、PI阴性，表示早期凋亡细胞；右上区为Annexin V-FITC和PI均阳性，表示死亡细胞及中晚期凋亡细胞。各实验组（250、500、750、1 000 nmol/L） 早期凋亡率分别为7.20%±0.36%、13.77%±0.21%、16.31%±0.20%和18.67%±0.49%，与对照组（5.93%±0.61%）比较，实验细胞早期凋亡率明显增加，差异有统计学意义 （P ＜0.05） 。

2.2 Western blotting法检测经PP242处理后SRA01/04的Bax蛋白表达情况

如图2所示，实验组Bax蛋白表达水平随PP242浓度的增加而增加。各实验组与对照组比较差异有统计学意义 （P ＜ 0.05） 。

2.3 实时定量PCR检测经PP242处理后SRA01/04的Bax mRNA表达情况

各实验组 （250、500、750、1 000 nmol/L） Bax mRNA相对表达量分别为2.157±0.125， 3.733±0.302，5.596±0.261和7.436±0.167，与对照组比较，差异有统计学意义 （P ＜ 0.05） 。提示Bax mRNA表达量随PP242浓度的增加而增加。

3 讨论

图1 各组HLEC Annexin V+PI 双染流式细胞分析散点图Fig.1 Flow cytometry analysis of apoptosis in HLEC after treatment with PP242

图2 免疫印迹法检测经PP242处理后SRA01/04的Bax蛋白表达情况Fig.2 Immunoblotting for Bax protein expression after treatment of cells with PP242

PCO是晶体摘除术后最常见的并发症［4］。目前公认的发病原因是由于手术中剩余的晶状体上皮细胞上皮-间质转化、晶状体上皮细胞增生和移行造成后囊的皱缩，术后剩余的晶状体上皮细胞移行过程中，形成微小细胞簇，导致了后囊膜的混浊和囊袋的皱缩和变形［3］。由于晶状体手术的改良和人工晶状体的更新，使PCO较前降低。目前治疗PCO的主要方法是后囊膜截开术，但手术局限性高，术后并发症严重 （视网膜脱离、黄斑水肿等）［5］。保守治疗PCO已经成为基础研究的重点。多种炎性细胞因子及生长因子可以影响晶状体上皮细胞的凋亡，这跟肿瘤细胞相似。因此，抗肿瘤药物是否可以用于PCO的防治是目前研究的热点。

磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 （phosphoinositide3-kinases/protein kinase B/mammal target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR） 通 路可以影响肿瘤细胞的生长［6］。激活mTOR通路对晶状体上皮细胞有促进增殖诱导凋亡的作用［7］。经典的PI3K/AKT/mTOR通路经典的抑制剂雷帕霉素，仅影响mTORC1即可诱导细胞凋亡［8］。PP242对mTORC1和mTORC2均有影响，可以抑制mTOR的催化活性及其自身磷酸化［9］。因而，PP242诱导凋亡的作用更加显著［10］。

细胞凋亡是细胞程序性死亡，由多种基因影响控制［11］。促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白共同存在于细胞内，当凋亡信号发出时，2类蛋白的平衡模式被破坏，促调亡蛋白增多，细胞凋亡［12］。细胞凋亡由多种基因及细胞因子影响，主要有以下2种途径：死亡受体通路和Bcl-2家族介导的线粒体通路［13］。本研究结果表明，进入早期凋亡的细胞比例随PP242浓度的增加而逐渐增加，提示PP242可以诱导HLECs凋亡，并随着浓度增加而增强。

Bcl-2家族介导的线粒体通路在细胞凋亡中作用显著［14］。在线粒体上，Bcl-2家族蛋白通过影响线粒体的稳定性，从而影响细胞凋亡。Bcl-2家族有2种蛋白：一种是以Bax代表的促凋亡蛋白，一种是以Bcl-2为代表的抗凋亡蛋白［15］。Bax主要在线粒体外膜起破坏膜完整性的作用。细胞接到凋亡信号后，Bax增加线粒体膜通透性，促凋亡蛋白及细胞因子进入细胞质，细胞发生凋亡［16］。

本研究结果表明，HLECs中Bax蛋白及Bax mRNA的表达随PP242浓度的增加而逐渐增强。因此，PP242使促凋亡基因Bax的表达增高，增加了Bax对HLECs凋亡的促进作用。提示PP242是通过引起Bax的改变来促进HLECs的凋亡，既而表明在PP242诱导的HLECs凋亡过程中有Bcl-2家族介导的线粒体通路的参与。

PP242可以诱导HLECs的凋亡，通过使促凋亡蛋白Bax的表达增加，诱导细胞凋亡，在PP242诱导的HLECs凋亡过程中有Bcl-2家族介导的线粒体通路的参与。然而，在本研究中仅观察到在HLECs凋亡过程中，PP242使促凋亡蛋白 Bax表达增加，而在此过程中，PP242是否通过影响其他途径诱导凋亡仍需要更多的研究来证明。

［1］ LEISCHING GR，LOOS B，BOTHA MH，et al. The role of mTOR during cisplatin treatment in an in vitro and ex vivo model of cervical cancer ［J］. Toxicology，2015，33 （5） ：72-78. DOI：10.1016/j.tox.2015.07.010.

［2］ ONO A，OIKE R，OKUHASHI Y，et al. Comparative effects of PP242 and rapamycin on mTOR signalling and NOTCH signalling in leukemia cells ［J］. Anticancer Res，2013，33 （3） ：809-813.

［3］ 白雪，冯浩，张柳，等. PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响［J］. 中国医科大学学报，2016，45 （4） ：324-327.DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.009.

［4］ MARTINEZ G，DE IONGH RU. The lens epithelium in ocular health and disease ［J］. Int J Biochem Cell Biol，2010，42 （12） ：1945-1963.DOI：10.1016/j.biocel.2010.09.012.

［5］ MILANI P，PIERRO L，PECE A，et al. Retinal photoreceptor focal disruption secondary to accidental Nd：YAG laser exposure ［J］. Int Ophthalmol，2011，31（ 5） ：409-412.DOI：10.1007/s10792-011-9469-1.

［6］ POLIVKA J，JANKU F. Molecular targets for cancer therapy in the PI3K/AKT/mTOR pathway［ J］. Pharmacol Ther，2013，142（ 2） ：164-175. DOI：10.1016/j.pharmthera.2013.12.004.

［7］ 浦利军，杨勤.雷帕霉素对大鼠糖尿病性白内障晶状体上皮细胞凋亡蛋白Bcl-2/Bax表达的影响［J］.中国生化药物杂志，2014，34（9） ：10-13.

［8］ WANG BT，DUCKER GS，BARCZAK AJ，et al.The mammalian target of rapamycin regulates cholesterol biosynthetic gene expression and exhibits a rapamycin-resistant transcriptional profile［ J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（ 37） ：15201-15206. DOI：10.1073/pnas.1103746108.

［9］ ZENG ZH，SHI YX，TSAO T，et al. Targeting of mTORC1/2 by the mTOR kinase inhibitor PP242 induces apoptosis in AML cells under conditions mimicking the bone marrow microenvironment［ J］. Blood，2012，120（ 13） ：2679-2689.DOI：10.1182/blood-2011-11-393934.

［10］ 贾松柏，石晶明，陈翾，等，紫外线对人晶状体上皮细胞凋亡的诱导剂Bcl-2，Bax基因的影响［J］. 中南大学学报，2012，37（ 7） ：730-735.

［11］ LEE KH，PARK E，LEE HJ，et al. Effects of daily quercetin-rich supplementation on cardiometabolic risks in male smokers［ J］. Nutr Res Pract，2011，5（ 1） ：28-33.DOI：10.4162/nrp.2011.5.1.28.

［12］ MILACKOVA I，PRNOVA MS，MAJEKOVA M，et al.2-Chloro-1，4-naphthpquinone derivative of quercetin as an inhibitoe of aldose reductase and anti-inflammatory agent ［ J］. Enzyme Inhib Med Chem，2014，30（ 1） ：107-113. DOI：10.3109/14756366.2014.8929 35.

［13］ ZHANG XA，ZHANG S，YIN Q，et al.Quercetin induces human colon cancer cells apoptosis by inhibiting the nuclear factor-kappa B pathway［ J］. Pharmacoqn Mag，2015，11（ 42） ：404-409. DOI：10.4103/0973-1296.153096.

［14］ OZYURT H，CEVIK OZGEN Z，et al. Quercetin protects radiationinduced DNA damage and apoptosis in kidney and bladder tissues of rats［ J］. Free Radic Res，2014，48（ 10） ：1247-1255. DOI：10.1016/S0167-8140（ 15） 31929-0.

［15］ LI Y，JIA Y，ZHOU J，et al. Effect of methionine sulfoxide reductase B1 silencing on high-glucose-induced apoptosis of human lens epithelial cells［ J］. Life Sci，2013，92（ 3） ：193-201. DOI：10.1016/j.lfs.2012.11.021.

［16］ 刘思源，康刚劲. 不同浓度17 β-雌二醇对雌性大鼠晶状体上皮细胞凋亡的影响［J］. 眼科新进展，2011，31（ 8） ：725-729.