张 敏， 马晓宁， 李成涛， 赵 冬

(1.陕西科技大学 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室, 陕西 西安 710021; 2.陕西科技大学 环境科学与工程学院, 陕西 西安 710021)

0 引言

由丁二酸和丁二醇缩合聚合的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)具有良好的成型加工性、力学性能和生物相容性，成为最具前景的可生物降解材料之一[1-3]，Lee等人的研究证明了PBS可以有效的被脂肪酶和细菌所降解，如Pseudomonaslipases和Burkholderiacepacia[4-6].南极假丝酵母脂肪酶B (Candidaantarcticalipase B,CALB)是一种可有效降解脂肪族聚酯的生物催化剂，它具有底物特异性和较高的稳定性能等优点[7-10]，已被广泛的应用于工业生产和研究中.

脂肪酶对脂肪族聚酯的降解是一个非常复杂的过程，宏观角度来讲涉及酶的吸附，侵蚀位点的识别以及对底物的侵蚀，微观角度分析涉及催化过程中聚酯底物构象的变化和酶整体结构以及局部活性残基位点的改变[11-13].

本研究通过在PBS分子主链结构引入二元醇和二元酸，采用CALB降解PBS基共聚物，研究其降解性能，探讨其降解机理.采用分子模拟方法，所用软件为YASARA V13.12[14]和AutoDock4.2[15,16]，对酶与底物分子对接的结合自由能进行计算，模拟酶催化位点与底物的相互作用，为脂肪酶降解脂肪族聚酯材料提供理论指导和基础数据.

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

(1)主要试剂：聚(丁二酸丁二醇-co-丁二酸戊二醇酯)[P(BS-co-PeD)]，聚(丁二酸丁二醇-co-戊二酸丁二醇酯)[P(BS-co-GA)]均为自主合成.南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，酶活力为10 000 PLU/g，购置于Novozymes (中国)投资有限公司.

(2)主要仪器：液相色谱-质谱仪联用(LC-MS)，WASAD2/E2695*型，美国Waters公司.

1.2 实验过程

以LC-MS对P(BS-co-PeD)和P(BS-co-GA)共聚酯的降解产物进行分析，电喷雾离子源(ESI)，离子源喷射电压为4 000 V，金属毛细管温度400 ℃，扫描范围：100～1 200 m/z，辅助气N2.

1.3 理论方法

1.3.1 分子动力学模拟

分子动力学计算采用YASARA V13.12，设计水相体系，对酶CALB进行50 ns的动力学模拟，载入初始结构是PDB编码为1 TCA的蛋白质.模拟过程中采用周期性边界条件，力场为AMBER 03，模拟体系温度为45 ℃，压力为1.0×105Pa，pH=7.20，温度耦合和压力耦合均采用Berendsen算法，体系包含水分子数4 000，Na+和Cl-用以平衡体系电荷.模拟前，体系通过最陡下降法经历5 000步优化能量，所有MD模拟步长均为2 fs，并采用100 ps平衡蛋白质，模拟时长50 ns，每10 ps存储一次数据用以分析.

1.3.2 分子对接模拟

用以分子对接的脂肪酶为分子动力学模拟输出的稳定阶段的平均结构.根据酸醇物质的量之比为1.0∶1.1，设计底物模型BSB、PeDSPeD、GASGA为羟基封端，如图1所示，B、S、PeD和GA分别为1,4-丁二醇、1,4-丁二酸、1-5-戊二醇和1,5-戊二酸的简写，对接前用ChemOffice v8.0，MM2力场对底物进行能量最小化；同时删除蛋白质中不必要的水分子，进行加氢并优化氢键，对所有残基加电荷.以MGL tools，AutoGrid4.2和AutoDock 4.2对配体-蛋白质进行对接，计算方法采用Lamarckian genetic algorithm，根据催化三联体中丝氨酸Cα位置确定网格参数，最终获得配体与蛋白质之间的结合构象，输出结合最优构象，在PyMOL中进行三维可视化处理，研究CALB与不同底物的相互作用，为实验提供理论依据.

(a)BSB

(b)PeDSPeD

(c)BGAB图1 分子模型示意图

2 结果与讨论

2.1 PBS基共聚酯的降解产物分析

为了更加深刻的了解CALB对PBS共聚酯的降解行为，以LC-MS对两种共聚物的降解产物进行了分析研究，如图2所示，均为ESI-负离子扫描，从图2中的离子峰可以看出，共聚物经过CALB降解后，均产生了低聚物和小分子物质，其中共聚物P(BS-co-20PeD)降解产生了13种物质，P(BS-co-20GA)为17种.

(a)P(BS-co-PeD)

(b)P(BS-co-20GA)图2 共聚酯降解产物的LC-MS谱图

经分析可知两种共聚物的降解产物中均有m/z为117和189的物质，分别为S单体和BS单元，表明酶均可对两种共聚物进行有效降解，如图2(a)所示，共聚物P(BS-co-20PeD)在m/z为461.60的相对丰度最高，分析其为L(BS)(PeDS) PeD、L(PeDS)2B和LPeDS(BS)PeD低聚物，说明CALB能够对PeDS之间的酯键进行识别并进攻；如图2(b)所示，共聚物(BS-co-20GA)在m/z为647.53的相对丰度最高，分析其为L(BGA)3B、L GA(BS)3和L S(BS)2(BGA)低聚物，同样说明CALB能够切断BGA之间形成的酯键，实现降解.结合之前酶降解实验可知P(BS-co-20GA)和P(BS-co-20PeD)的质量损失率分别为93%和85%，可以说明，P(BS-co-20GA)具有较好的降解性能，CALB可有有效催化P(BS-co-20GA)，产生多种小分子物质.

2.2 分子动力学模拟

在酶催化降解过程中，酶调整自身结构使底物能够顺利进入酶的活性口袋，从而实现对底物的降解.首先，对初始结构的水相体系下的CALB进行50 ns的分子动力学模拟，如图3所示.根据Cα的均方根偏差(RMSD)判断CALB是否达到稳定，如图3(a)所示.

(a)CALB中的Ca

(b)BGAB/PeDSPeD-CALB图3 分子动力学模拟的RMSD值

在模拟的初始阶段，10 ns以下，蛋白质进行分子内运动，对整个系统的结构进行了重大调整，因此RMSD值具有很大的变化范围.10～25 ns，尽管蛋白质的局部结构保持较好，但蛋白质的各个结构域都发生相对运动，导致整体RMSD波动，25 ns后，RMSD较小的波动表示蛋白质的总体结构趋于稳定.输出平衡阶段的平均结构用于后续的模拟研究.为了获得催化反应过程中酶二级结构的改变，对CALB与不同配体体系进行了50 ns的分子动力学模拟，如图3(b)所示.CALB的催化三联体为Ser105-His224-Asp187、螺旋链α5(142-146)和α10(268-287)位于酶活性口袋附近，螺旋链α5在配体进入活性口袋过程起到重要作用.图3(b)说明除了在螺旋链α5周围的氨基酸残基(140～148)外，其它残基的RMSD值均小于2 Å.BGAB-CALB体系的氨基酸残基140～148处的RMSD值9.6 Å明显高于PeDSPeD-CALB体系7.3 Å，说明螺旋链α5的柔顺性更好，链段的运动性高，提高了CALB对底物进入酶活性口袋的适应能力，从而使得活性口袋能够更好的容纳底物.因此CALB对GA单体改性PBS共聚物表现出出色的催化能力.分子动力学模拟结果与降解实验结果相互佐证.

2.3 分子对接模拟

分子对接模拟可以得到脂肪酶CALB与不同底物模型的结合自由能以及活性位点与配体的相互作用，如表1和图4所示.表1为分子对接结合自由能数据.

表1 AutoDock程序的配体-CALB对接结果

已知结合自由能(Ebinding)包含分子间能(Einter-mol)，分子内能(Etotal-internal)和分子扭转能(Etorsional)，其中Einter-mol包括范德华作用(EvdW)、氢键作用(Ehbond)、去溶剂化作用(Edesolv)和静电作用(Eelec).

从表1可以看出，CALB与配体BSB、PeDSPeD、BGAB的结合自由能分别为-16.91 kJ·mol-1、-19.93 kJ·mol-1和-22.94 kJ·mol-1，CALB与PeDSPeD和BGAB的结合自由能均低于与BSB的，表明五碳直链二元醇和二元酸改性PBS有利于其与CALB的结合，对比PeD和GA，GA单元的结合能最大，说明BGAB与CALB的结合易于进行且结合最稳定，因此共聚物P(BS-co-GA)表现出优异的降解性能.

聚物进入酶的活性口袋，通过化学键的扭转暴露酯基与酶的氨基酸残基形成氢键以保证催化反应的顺利进行.通过底物与CALB的相互作用分析，如图4所示，底物中与酰氧基直接相连的氧原子与酶的氨基酸残基His224上的氮原子形成了氢键，将其氢键的键长设为a，酰氧基上的氧与氨基酸残基Thr40和Gln106上亦可形成氢键，主要起到稳定底物过渡态的作用.通过对比可知，BSB-CALB、PeDSPeD-CALB和BGAB-CALB的a值分别为：2.4 Å、2.3 Å和1.9 Å.酶是否能有效催化底物主要由亲核加成和底物过渡态的稳定决定，较小的a值可促进亲核加成反应的进行，Thr40和Gln60可以稳定过渡态以保证后续反应的进行.从图4中底物和CALB之间相互作用的分析可知，BGAB-CALB体系最为稳定.这与对接所得的结合自由能数据相吻合，同时也与降解实验相互佐证.分子模拟说明，CALB对含有第三组分单体单元的底物，尤其是GA单体，具有良好的容纳性；同时分子对接结果表明第三组分单体的引入均可提高底物与酶对接的稳定性，良好的相容性和较大的结合自由能可确保催化反应的顺利进行，因此P(BS-co-PeD)和P(BS-co-GA)具有良好的降解性能.

(a)BSB-CALB

(b)PeDSPeD-CALB

(c)BGAB-CALB图4 配体-CALB的相互作用图

3 结论

无规PBS基共聚物P( BS-co-PeD)和P( BS-co-GA)，具有优良的可生物降解性能.MD模拟可知CALB催化底物模型为BGAB时，其活性口袋附近，螺旋链α5表现出较高的柔性和运动性，表明CALB对GA单体存在的底物具有良好的容纳性.分子对接结果表明CALB与BGAB的结合能最大，结合最稳定，最有利于酶催化反应的进行.结合酶降解实验及LC-MS降解产物分析，共聚酯P(BS-co-GA)具有较高的降解率和多种降解产物，说明CALB可对共聚酯P(BS-co-GA)进行高效的催化降解，与分子模拟结果一致.

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