实验室检测与校准的方法验证和方法确认

2018-05-25康婕

农产品加工 2018年9期

康婕

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048）

0 引言

检测方法是一项检测技术程序，是实验室管理体系中技术要求的一个重要要素，是实验室管理体系中过程要求的一项核心要素。实验室可以选择的检测方法有标准方法和非标方法。标准方法需要进行验证工作，而非标方法则需要开展确认工作。然而，许多实验室的检测人员不能完全理解方法确认和方法验证的概念，所以对方法验证和方法确认进行系统性论述，旨在为检测实验室进行验证和确认提供参考。

1 方法验证和方法确认的区别

1.1 概念

ISO/IEC 99—2007指南，2.44中规定“方法验证是实验室通过核查，提供客观有效证据证明满足检测方法规定的要求”；ISO/IEC 99—2007指南，2.45中规定“实验室通过试验，提供客观有效证据证明特定检测方法满足预期的用途”[1]。准确地讲，方法验证着重于检测方法会不会用，方法确认则着重于该检测方法能不能用。

1.2 目的

由概念可以看出，方法验证旨在实验室是否有能力按标准方法开展实验室活动（包括检测、校准和抽样），主要着重于能否出具充分的客观依据。方法确认则主要看该非标方法是否能合理、合法使用。

1.3 范围

方法验证是实验室内方法验证。方法确认包括实验室内方法确认和实验室间方法确认。方法确认的研究领域要比方法验证广得多。

1.4 时机

方法验证是在实验室引入检测与校准之前证实运用标准方法的正确性，方法确认应在首次使用非标方法（书、期刊、一起）之前确认，方法实施（新的基质、检测仪器变化、样品前处理变化等）或者工作环境发生了改变，或长期停用后的再确认，当方法偏倚时也应当进行确认。

1.5 对象

方法验证适用于标准方法，标准方法是由公认机构通过评价确认之后向社会公开颁布的技术规范文件，包括：①国内标准（国家标准、行业标准和地方标准）；②国际标准（如ISO，IEC，ITU等颁布的标准）；③区域标准（如欧洲标准化委员会（CEN）等颁布的标准）；④国外标准（如ANSI，DIN，BSI等颁布的标准）。

方法确认适用于：①非标方法；②实验室设计（制定）的方法；③超出其预定范围使用的标准方法（例如，当检测标准要求测定物含量需小于1%，而实际待测物为8%～12%，实验室采用该标准对待测物进行了检测，这就是超出标准要求范围进行的检测，所获得的结果依然是准确且有效的）；④扩充和修改过的标准方法[2]（例如，一则标准是应用于饮料中某项指标的检测，细微修改后用来当作白酒中某项指标的检测，对检测结果进行有效性评估后发现测试数据准确有效，则此修改过的标准方法可靠有效）。方法确认应尽可能全面，以满足预定用途或应用领域的需要。但是以下几种情况不需要再进行确认：①知名技术组织公布的、国际上普遍采用、行业广泛认可的某些公司或者行业协会的标准，通常可以不进行确认而直接使用；②对于获得政府、行业组织承认的非标准方法可直接证实使用，不需进行确认；③对科学书籍和期刊公布的方法，若是国际普遍采用或行业广泛认可的，可以直接证实使用；④对于仪器供应商提供的方法，若检测与校准对象跟其描述的类型、范围相同，且该方法为行业内公认，则可直接证实使用。

2 方法验证和方法确认的内容

2.1 方法验证

通常而言，实验室在新检测标准投入使用前或者已经确认过的方法出现微小改动时（如改变稀释了浓度指标，选用不同厂家的柱子等）需要进行方法验证，进行验证时需要从人力资源、设备、环境条件、试剂等几个方面去验证是否有能力开展实验室活动（包括检测、校准和抽样），当综合考量上述条件均满足检测的要求后，还需进一步验证实验室是否有能力满足标准方法的要求。如何进行实验室验证依赖于检测目标物的种类和实验室手段的性质。关注基础参数（如回收率、线性、精密度、不确定度等）是否能达到实验室标准要求。

2.2 方法确认

方法确认工作不是一项偶然行动，是经过计划和准备的。方法确认的内容应该广泛且全面，以满足预定用途或应用领域的需要。标准方法的确认准则是：所用的人员、设备、试剂、环境等以证明实验室能够正确使用该新标准实施检测过程，确定技术路线和相关参数。非标方法的确认通常从以下5个方面确认。

（1）使用标准物质进行比较或者评定偏差和精度。应选择合适的标准物质（标准物质应该满足其准确度，应该优于拟确认方法的准确度；标准物质的种类、浓度范围应该与拟确认方法相符合），采用不确定度检验法和t检验法和回收率检验法进行方法确认。在用回收率试验进行评价时应该注意：加标量应该小于待测物含量的3倍；测定含量在mg/kg级时，回收率含量应该在90%以上，测定含量在μg/kg级时，回收率含量应该在80%以上，如果检测方法复杂可以低至70%。

（2）与其他方法所得的结果进行比较。可以采用t检验（应用t检验时，要求被检验的2组数据具有相同或者相近的方差）或F检验法进行检验和判断方法的显著性问题。但是应该注意进行t检验之前必须先进行F检验。

（3）实验室间比对。利用实验室间比对进行方法确认，即在同样条件下利用相同方法进行重复性检测和改变测试条件时利用不同方法进行复现性检测，得出重复性限r和复现性限R。

（4）对影响结果的因素作系统性评审。利用对结果的因素做系统性评价——加强性检验，对抵御外来影响的稳健度或抵御来自样品（或检测物）集体干扰的交互灵敏度进行方法确认。在作系统性评审进行方法确认时可进行配对比较，即固定一因素从而消除其他因素的影响，两侧测量结果用配对数据差值D来进行显著性检验分析。

（5）根据对方法的理论原理和实践经验的科学理解，对所得结果不确定度进行的评定。

3 方法验证和方法确认的参数

对于化学实验室而言，方法验证的技术参数有检出限、回收率、方法标准曲线和精密度试验。方法确认的技术参数除了有检出限、回收率、方法标准曲线和精密度试验外，还需要进行方法特异性（区分同分异构体）、抗干扰性、耐用性和测量不确定度评估[3]。实验室可在综合考虑成本、风险技术可行性基础上，并根据预期的用途进行方法确认，实验室进行方法确认的内容应尽可能全面且完整，包括但不限于以下方法特性，方法选择性、方法适用性、回收率、测量范围或线性范围、检出限或定量限，正确度、稳健度、灵敏度、精密度（重复性或复现性）、测量不确定度等。

3.1 检出限（LOD）

当被检组分的浓度不是很高，且特性不是很明显时，基于结果具有最大不确定度的期望时，通过方法检测所能达到的最低含量叫做检出限（LOD）。检出限（LOD）包括方法检出限（MDL）和仪器检出限（IDL），这2个概念不能相互混淆，信噪比可用来考查仪器性能但不适用于评估方法检出限。方法检出限是某特定分析方法在给定的置信度内（如95%，99%或99.7%）能检出待测样组分的最低含量（最小浓度或者最小量）。这里说的检出是指定性检出，即判定样品中存有浓度高于空白的待测物质，检出限是一种定性判断依据。

（1）基于空白标准偏差评估法。当空白样本的标准偏差不等于0时，独立测试样品空白，测定不少于10次，计算检测结果的标准偏差（S），空白+3倍标准偏差（3S）即为方法检出限（MDL）。当空白样本的标准偏差等于0时，在空白样品中添加最低可接受的浓度（添加量不少于10次），检测待测物的浓度，计算标准偏差（S），3倍标准偏差（3S）即为方法检出限（MDL）。

（2）校准公式适用范围评估法。利用校准方程的参数来确定检出限，如果空白平均值+3倍标准偏差（3S），校准方程的截距a为仪器对于空白的响应，仪器响应的标准偏差是校准的标准误差（Sy/x），利用校准方程：yLOD=a+3Sy/x=a+bxLOD，则xLOD=3Sy/x/b（校准曲线的斜率）得到检出限。

（3）确定检出限的方法。在某些分光光度法中，以口出空白后与0.01吸光度对应的浓度可为检出限，气相色谱分析的最小检测量是指检测器刚能产生与噪音相区别的响应信号时进入色谱柱的物质的最小量，通常认为刚能辨别的响应信号是噪音的2倍，最小检测浓度为最小检测量与进样量体积的比。

3.2 定量限（LQD）

定量限（LQD）是指某特定分析方法在给定置信度和允许误差范围内能够从样品中定量检出待测组分的最低浓度或最低量。定量限（LQD）也成定量检测下限或者报告限，其结果能保证一定的正确度和精密度。但是当待测物的最低浓度或者最低量在检出限（LOD）和定量限（LQD）之间时，准确度就没有保障，此时检测结果不一定准确。美国国家标准局定义10倍空白标准偏差（即10σ空）。

痕量分析准则见表1。

表1 痕量分析准则

3.3 线性

对于任何定量的方法，都需要确定被分析物浓度的适用范围，因此实验室应该确定检测方法校准曲线的线性范围。在线性范围内信号反应与被分析物的浓度呈线性相关，实验室建立标准曲线应覆盖不同浓度（或数量级），6个及其以上（包括空白）校准点，以操作反应信号为y轴，以操作浓度为x轴，制作标准曲线，确定各种浓度的最大和最小的线性范围。对于筛选方法，线性回归方程的相关系数要不低于0.98；对于准确定量的方法，线性回归方程的相关系数要不低于0.99。相性范围确定时应该尽量满足以下要求：①校准用的校准点应该覆盖目标物浓度的50%～150%，如果需要做空白试验，则应该覆盖目标物浓度的50%～150%；②校准用的校准点应尽可能均匀分布在目标物浓度内，不同浓度应该独立配制，不能通过稀释高浓度校准点配制；③每个校准点至少重复测定2次，建议3次或者更多次。

3.4 精密度

精密度是在规定条件下，独立检测结果间的一致程度。精密度说明检测人员检测结果的稳定性。精密度的度量通常以不精密度表达，量值用检测结果的标准差来表示，精密度越低，标准差越大。精密度与真值或者可接受的参考值无关，仅取决于随机误差的分布。禁用物质在进行精密度试验时，应在LOD、2倍LOD和10倍LOD 3个水平进行，对于已经制定最高残留量（MRL）的，应在LOD，MRL选择合适的点三水平进行，对于没有制定最高残留量（MRL）的，应在LOD、常见限量指标选择合适的点三水平进行。每个点的重复测定次数不得小于6次。测试结果通过实验室内变异系数表达，标准偏差（S）可用Bessel公式计算得到（CV=标准偏差/平均值）。

3.5 重复性限或复现性限

重复性限（r）是指重复性条件下由同一操作者测定2次，2次测试结果的绝对差值不超过此数的概率为95%，再现性限（R）是指在不同的实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，对统一被测对象独立进行测试，2次测试结果的绝对差值不超过此数的概率为95%。r和R均通过实验室协作获得，一般要求协作实验室不少于8家。