（吉首大学化学化工学院，湖南吉首 416000）

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷（Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.）的干燥叶，有清肺止咳、降逆止呕的功效，主要用于治疗肺热咳嗽、胃热呕逆、口渴烦热[1]等症。由于枇杷叶的平咳祛痰功效可能与其机体免疫调节功能密切相关，而多糖物质的一个主要活性就是免疫调节[2-4]，故对其提取方法进行优化选择，为枇杷叶中水溶性多糖的提取提供参考。

多糖因具有抗炎症、抗凝血、抗辐射、降血脂等作用，而成为天然药物的研究热点之一，植物多糖的提取物现已被制成多种保健品。现有研究表明，枇杷叶多糖能明显提高小鼠抗疲劳能力，目前全球至少有12种多糖分别作为抗肿瘤药物正在进行临床试验。枇杷叶多糖成品液可制成枇杷叶多糖口服液或枇杷叶多糖口服胶囊，易服用和携带。

目前，国外对于枇杷叶多糖的研究报道较少，而国内的研究主要集中在提取枇杷萜类、熊果酸、苦杏仁苷等方面，仅有的几篇枇杷多糖提取的研究报道也多集中在酸浸碱提、超声波提取[5]、超声-微波协同萃取[6]，少有超声波辅助酶法提取枇杷叶多糖的研究报道。开展枇杷叶多糖的综合提取研究工作，可为枇杷资源综合利用提供科学依据。

1 试验部分

1.1 仪器和药品

1.1.1 试验仪器

DS-1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂产品；SB-3200YDTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；HH.S型精密恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂产品；GZX-9246MBE型数显热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；LXJ-IIB型飞鸽牌离心机，上海安亭科学仪器厂产品；ES-3KCA型电子计数天平，沈阳龙腾电子有限公司产品；721E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；PHS-25型数字式pH计，上海日岛科学仪器有限公司产品。

1.1.2 试验材料

枇杷叶，产自湖南湘西自治州；果胶酶（1 016 250 U/g，湖州纯米生物科技有限公司提供；蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、95%乙醇，均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 枇杷叶多糖提取工艺流程

枇杷叶→清洗→干燥→粉碎→过筛→称量→料液混匀→超声波处理→冷却→调pH值→酶解处理→灭酶→离心分离→取上清液测量体积→乙醇沉淀→离心→取沉淀溶解稀释→测定多糖得率。

1.2.2 枇杷叶多糖含量的测定

采取硫酸-蒽酮法测定枇杷叶多糖含量，吸取枇杷叶多糖样液之前充分摇匀，在波长620 nm处测量其吸光度，根据回归方程计算枇杷叶多糖含量。

1.2.3 单因素试验

分别探讨超声波处理时间、料液比、酶解时间、果胶酶用量、酶解温度、pH值对枇杷叶多糖提取效果的影响。

1.2.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，选择果胶酶用量、酶解温度、pH值、料液比为响应面优化的考查因素，以枇杷叶多糖提取率为响应值进行中心组合试验设计，在多组试验得出试验数据的基础上，运用SAS 8.1软件对所得数据进行处理，得到优化试验工艺参数，并进行验证性试验[7-9]。

1.2.5 枇杷叶多糖得率的计算

式中：C——样液中多糖质量浓度，mg/mL；

D——样液体积，100 mL；

E——上清液体积，mL；

F——吸取上清液体积，10 mL；

W——枇杷叶质量，mg。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助酶法单因素试验

2.1.1 超声波处理时间对枇杷叶多糖得率的影响

称取枇杷叶粉末5.0 g，料液比1∶10（g∶mL），超声波处理温度50℃，处理时间分别为30，45，60，75，90 min，冷却，调pH值为4.5，再用添加量为0.4%的果胶酶处理，在50℃水浴酶解2 h后于80℃下水浴灭酶15 min。

超声波处理时间对枇杷叶多糖得率的影响见图1。

由图1可知，枇杷叶多糖得率随着超声提取时间的延长而升高，在60 min达到最大，而在60～90 min，枇杷叶多糖得率没有明显变化。由于在提取的初期，超声波对细胞膜的破碎作用比较大，枇杷叶多糖被不断浸出，但随着提取时间的延长，枇杷叶多糖的浸出量达到最大，再延长时间也不能将多糖得率提高，故超声波处理时间选择60 min。

图1 超声波处理时间对枇杷叶多糖得率的影响

2.1.2 料液比对枇杷叶多糖得率的影响

称取枇杷叶粉末5.0 g，料液比分别为1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶20 （g∶mL），超声波处理温度为50℃，处理时间为30 min，冷却，调pH值为4.5，再用添加量0.4%的果胶酶处理，在50℃水浴中酶解2 h后于80℃条件下水浴灭酶15 min。

料液比对枇杷叶多糖得率的影响见图2。

图2 料液比对枇杷叶多糖得率的影响

由图2可知，枇杷叶多糖得率随着料液比增加而升高，在料液比1∶16时达到最高，之后随料液比增加而下降。由于料液比1∶10时，体系黏稠度大，经超声处理后体系内乳化现象严重，酶与底物接触不充分，酶解效果差；随着料液比增加，乳化现象减弱，酶解效果增强；继续增加料液比，底物浓度降低，酶解效果减弱，多糖得率下降，故料液比选择1∶16。

2.1.3 酶解时间对枇杷叶多糖得率的影响

称取枇杷叶粉末5.0 g，料液比为1∶16（g∶mL），超声波处理温度50℃，处理时间30 min，冷却，调pH值4.5，再用添加量为0.4%的果胶酶处理，在50℃水浴酶解，时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，于80℃下水浴灭酶15min。

酶解时间对枇杷叶多糖得率的影响见图3。

由图3可知，枇杷叶多糖得率随着酶解时间增加而升高，当酶解时间超过2 h后，枇杷叶多糖得率增加趋于平缓。这主要是因为时间短，酶促反应不充分；增加酶解时间可以使果胶酶对细胞壁中的果胶物质充分酶解，但酶解时间过长，酶的催化活性降低，进而对枇杷叶多糖得率影响不大，所以酶解的最佳时间为2 h。

图3 酶解时间对枇杷叶多糖得率的影响

2.1.4 果胶酶添加量对枇杷叶多糖得率的影响

称取枇杷叶粉末5.0 g，料液比1∶16（g∶mL），超声波处理温度50℃，处理时间30 min，冷却，调pH值4.5，分别用添加量0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%的果胶酶处理，在50℃水浴酶解2 h后于80℃下水浴灭酶15 min。

果胶酶添加量对枇杷叶多糖得率的影响见图4。

图4 果胶酶添加量对枇杷叶多糖得率的影响

由图4可知，枇杷叶多糖得率随着果胶酶添加量增加而升高，由于果胶是植物组织中与纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等结合的不溶于水的一类物质，果胶酶有利于多糖的释放，当果胶酶添加量超过1.6%后，枇杷叶多糖得率的增加趋于平缓，综合考虑酶成本及多糖得率，故果胶酶添加量为1.6%。

2.1.5 酶解pH值对枇杷叶多糖得率的影响

称取枇杷叶粉末5.0 g，料液比1∶16（g∶mL），超声波处理温度50℃，处理时间30 min，冷却，调pH值分别为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，再用添加量为0.4%的果胶酶处理，在50℃水浴中酶解2 h后于80℃下水浴灭酶15 min。

酶解pH值对枇杷叶多糖得率的影响见图5。

图5 酶解pH值对枇杷叶多糖得率的影响

由图5可知，枇杷叶多糖得率在pH值为4.5最高，由于果胶酶受pH值影响较大，pH值4.5时果胶酶发挥最大活力，破坏细胞壁的效率大大增强，使枇杷叶溶出效率也达到最大值；pH值过高或者过低都会抑制果胶酶活力；pH值可以通过影响底物分子的解离影响反应速度，故选择pH值为4.5。

2.1.6 酶解温度对枇杷叶多糖得率的影响

称取枇杷叶粉末5.0 g，料液比为1∶16（g∶mL），超声波处理温度50℃，处理时间30 min，冷却，调pH值4.5，用添加量为0.4%的果胶酶处理，分别在水浴温度为35，40，45，50，55℃的条件下酶解2 h后于80℃条件下水浴灭酶15 min。

酶解温度对枇杷叶多糖得率的影响见图6。

图6 酶解温度对枇杷叶多糖得率的影响

由图6可知，随着酶解温度升高，枇杷叶多糖得率在50℃最高，高于50℃时，多糖得率反而下降。由于温度升高时，分子热运动加快，活化分子数增多，从而使反应速度加快；超过最适温度后，随着温度升高酶蛋白开始变性，酶活力逐渐降低，从而影响多糖提取，故果胶酶酶解温度选择50℃。

2.2 Box-Behnken中心试验设计优化枇杷叶多糖提取工艺

2.2.1 优化试验

在单因素试验基础上，依据Box-Behnken中心设计原理，以果胶酶添加量（X1）、酶解温度（X2）、pH值（X3）、料液比（X4）为自变量，枇杷叶多糖得率为响应值，设计四因素三水平试验，共27个试验点，其中24个为分析因子（1～24），3个中心试验点（25～27）。

Box-Behnken试验设计因素与水平设计见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平设计

2.2.2 Box-Behnken试验设计方案及试验结果

Box-Behnken试验设计与结果见表2。

2.2.3 模型的建立及显著性检验

回归统计分析见表3。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 回归统计分析

经SAS 8.1软件对27个试验点的枇杷叶多糖得率进行回归分析，得出数学模型：

从表3可看出模型极显著（p＜0.000 1），因变量与所考查自变量之间的线性关系显著（R2=97.83%），模型调整确定系数=95.31%，说明响应值的变化有97.83%来源于所选因子变化，拟合程度良好，失拟项不显著（p＞0.05），说明试验所得二次回归方程高度显著，能很好地对响应值进行预测。一次项X3，X4及二次项表现为极显著，X2、X3X4显著，说明它们对响应值影响大，且所考查因素对响应值影响不是简单的一次线性关系。由表3可知，影响因素主次顺序为pH值＞料液比＞酶解温度＞果胶酶添加量。

2.2.4 响应面图形分析

果胶酶添加量（X1）、酶解温度（X2）、pH值（X3）、料液比（X4）交互作用的响应面及等高线图，直观地反映各因素对响应值的影响，找出最佳工艺参数及各参数之间的相互作用，从响应面的最高点和等高线可以看出在所选的范围内存在极值，响应面的最高点同时也是等高线中的最小椭圆的中心点。此外，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。

Y1=f（X1，X2）的响应面和等高线见图7（a），Y1=f（X1，X3）的响应面和等高线见图 7（b），Y1=f（X1，X4）的响应面和等高线见图 7（c），Y1=f（X2，X3）的响应面和等高线见图 7（d），Y1=f（X2，X4）的响应面和等高线见图 7（e），Y1=f（X3，X4）的响应面和等高线见图 7（f）。

2.2.5 最优条件的求解及验证

由SAS软件分析并考虑实际操作性，故选定调整后工艺参数为酶添加量1.9%，酶解温度52℃，酶解pH值4.5，料液比1∶15。在优化后的条件下进行验证试验，重复3次，测得枇杷叶多糖得率为4.967%，4.971%，4.972%，即平均值为4.97%，与理论计算值误差在1%以内。

3 结论

通过单因素试验考查了果胶酶添加量、酶解温度、pH值、料液比对枇杷叶多糖得率的影响并通过响应面分析法优化分析，建立了枇杷叶多糖提取率的数学模型：得到的最佳的条件为超声波处理时间60 min，酶解时间2 h，酶添加量1.9%，酶解温度52℃，酶解pH值4.5，料液比1∶15。在此工艺条件下，枇杷叶多糖的理论得率4.973%，实际测得平均得率为4.97%。从测定结果发现，枇杷叶中可溶性多糖的含量较高，可回收提取利用，而超声波辅助酶法提取具有时间短、反应条件温和等优点，可供枇杷叶中水溶性多糖的提取提供参考。

参考文献：

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