楚雄医药高等专科学校，云南 楚雄 675000

松针(pineneedle)，别名猪鬃松毛、松毛、山松须，为松科松属植物的针状叶。松针是我国传统中药，在历代本草中均有记载。《别录》谓其：“主风湿疮，生毛发，安五脏”。《本草纲目》记载：“松针，气味苦、温、无毒，久服令人不老，轻身益气，主风湿疮，生毛发，安五脏，守中，不饥延年”[1]。现代研究表明，松针具有镇痛、抗炎、镇咳、祛痰、抗突变、降血脂、降血压、抑菌等作用，其利用价值日益受到关注[2-4]。据文献报道，松针中含有山柰酚等黄酮类成分[5],山柰酚在防癌、抗癌、抗感染、抗炎及免疫抑制等方面有重要作用[6]。另外，山柰酚还能够降低血糖，改善胰岛素抵抗[7]。本研究对云南松松针中所含该活性成分采用TLC及HPLC进行了定性、定量研究，并对药材的水分、灰分、浸出物进行了测定，为制定松针的质量控制标准、开发新药奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津)；Sartorius BS 224S万分之一分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司)；SX2-4-10箱式电阻炉(上海-恒科学仪器有限公司)；索氏提取器；As10200型超声波清洗机(北京华博科技制造有限公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(上海科析试验仪器厂)。

1.2 材料 硅胶G预制薄层板(批号20141006,青岛海洋化工厂，100 mm×100 mm)；HPLC级乙腈(德国MERCK公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯；山柰酚对照品(批号MUST-13121112,成都曼思特生物科技有限公司)。松针药材9批，分别产自楚雄(2批)、南华、永仁、牟定、大姚、禄劝、大理、巍山。经楚雄医药高等专科学校生药教研室姚荣林教授鉴定为云南松(PinusyunnanensisFranch)松针。

2 方法及结果

2.1 水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的测定

2.1.1 测定方法[8]水分测定参照2015年版《中华人民共和国药典》四部0832项下水分测定法中第二法(烘干法)；总灰分、酸不溶性灰分测定参照2302项下灰分测定法；浸出物测定参照2201项下浸出物测定法，以乙醇为溶剂，采用热浸法测定醇溶性浸出物。

2.1.2 测定结果 9批样品的水分、总灰分和酸不溶性灰分、浸出物的测定结果见表1。9批云南松松针药材水分的平均含量为11.25%，总灰分的平均含量为3.28%，酸不溶性灰分的平均含量为0.27%，醇溶性浸出物的平均含量为20.83%。依照《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求，按其平均值的±20%作为限度的制定幅度，暂定云南松松针药材水分含量不得超过13.50%，总灰分不得超过3.94%，酸不溶性灰分不得超过0.32%，醇溶性浸出物不得少于16.66%。

表1 松针药材各检查项目及药材山柰酚质量分数

2.2 松针的薄层色谱(TLC)鉴别 取云南松松针粉末2g，加甲醇-20%盐酸(4∶1)混合溶液50 mL，回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取山柰酚对照品，加甲醇制成1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝显色，在紫外灯(365 nm)下检识，山柰酚荧光斑点清晰，分离效果理想。薄层色谱图如图1所示。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱:InertSustainC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相：乙腈∶0.3%磷酸水溶液(30∶70)；流速：1 mL/min；柱温：40℃；检测波长：365 nm，进样量：10 μL。色谱柱的理论板数按山柰酚计算应不低于6000，分离度大于1.5。如图2所示。

2.3.2 对照品溶液制备 取山柰酚对照品9 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加流动相甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，使成为0.9602 mg/mL的对照品储备液。

2.3.3 供试品溶液的制备 称取云南松松针粉末(4号筛)约1.0 g，精密称定，各加入甲醇-20%盐酸(4∶1)混合溶液25 mL，加热回流提取2次，每次1.5 h，合并滤液并定容至50 mL量瓶中，用0.45 μm滤膜过滤，备用[9]。

2.3.4 线性关系考察 精密量取对照品储备液1.0 mL置10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度，摇匀，配成0.09602 mg/mL的对照品；分别精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10 μL按上述色谱条件依次进样，以山柰酚进样量(μg)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=5×106X-9184.3,r=0.9998，山柰酚在0.19～0.96 μg范围内成良好的线性关系。如图2所示。

2.3.5 精密度试验 精密吸取山柰酚对照品溶液(0.096 02 mg/mL)10 μL,按上述色谱条件连续进样5次，记录山柰酚色谱峰峰面积RSD为0.84%，显示具有良好的精密度。

2.3.6 重复性试验 按“2.3.3”项下操作，处理同一样品5份，精密吸取10 μL进样检测，记录山柰酚的峰面积，计算RSD为1.21%(n=5)，表明实验方法的重复性较好。

2.3.7 稳定性试验 取同一份供试液，在“2.3.1”项色谱条件下，于0、4、8、12、16 h分别记录山柰酚峰面积，计算峰面积的RSD值为1.01%，表明供试液在16 h内稳定。

2.3.8 加样回收率试验 采用加样回收法，精密称取已知含量的药材适量，分别精密加入一定量的山柰酚对照品，按供试品制备与测定方法，在上述色谱条件下，平行做5组，结果测得其平均回收率为101.04%，RSD为1.02%。

2.3.9 样品测定 依上述方法，测定9批松针药材中山柰酚含量。结果见表1。色谱图如图3所示，图中1为山柰酚。

3 讨论

3.1 样品处理条件的确定 本研究考察了甲醇-10%盐酸(4∶1)、甲醇-20%盐酸(4∶1)和甲醇-30%盐酸(4∶1)3种水解溶剂。结果表明以甲醇-20%盐酸(4∶1)混合液作为水解溶剂时所得样品含量最高，故确定采用甲醇-20%盐酸(4∶1)混合液为水解溶剂。又以甲醇-20%盐酸(4∶1)混合液为溶剂，比较了回流和超声方法对提取率的影响，结果回流提取率明显高于超声。同时还进一步比较了不同提取时间和次数对提取效果的影响，最终确定提取2次，每次1.5 h基本能够提取完全。

3.2 薄层条件的确定 通过比较多种展开系统苯-乙酸乙酯-乙酸、环己烷-乙酸乙酯-甲酸、甲苯-乙酸乙酯-甲酸、环己烷-三氯甲烷-丙酮等，结果表明环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶5∶1)作为展开剂斑点清晰、分离度好。考察了三种不同品牌的薄层板:硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)、硅胶G薄层板(青岛美高集团有限公司)、自制硅胶G薄层板，均可对松针中山柰酚成分进行定性鉴别。按照试验所得薄层色谱条件，考察本品在温度15～29℃、相对湿度为40%～70%展开时，对薄层色谱结果的影响。结果表明，在上述温度、相对湿度范围内对该薄层色谱结果无明显影响，9批不同产地的松针样品均可检出山柰酚，斑点清晰且方法简便、快速、可行，此方法可用作松针药材的定性鉴别。

3.3 色谱条件优化 考察了2种色谱柱,InertSustainC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Phenomenex Gemini-NX C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱，结果显示，后者所得山柰酚峰和杂质峰分离效果较差，峰形展宽，而前者分离效果较好，故选择InertSustainC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱。对不同流动相系统(甲醇-水、乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.3%磷酸、甲醇-0.3%磷酸水溶液)，结果显示以乙腈-0.3%磷酸水溶液(30∶70)的分离效果较好，所得峰形及峰纯度最好。考察了不同流速(0.8、0.9、1.0 mL/min)、不同柱温(25、30、40 ℃)，确定最佳流速为1 mL/min，柱温40 ℃。在上述条件下测得山柰酚相对标准偏差、分离度均符合定量测定要求。

本实验首次比较全面建立了云南松松针药材水分、灰分、浸出物检查，薄层色谱鉴别以及药材含量测定方法，且方法简便、准确、灵敏度高，为松针药材的质量控制提供了科学依据。

参考文献

[1]李时珍.本草纲目[M]. 北京：人民卫生出版社，1982:1917-1923.

[2]李萍,刘友平. 松针研究进展[J]. 成都中医药大学学报，2001(24)：49-50.

[3]胡丰林，陆瑞利.松针的利用价值分析[J].生物学杂志，1996,70(2)：25-26.

[4]毕跃峰，郑晓珂，冯卫生.松针的研究进展及开发利用[J].河南中医药学刊，1999,14(2)：14-17.

[5]刘东彦，石晓峰，李冲，等.雪松松针醋酸乙酯部位化学成分研究[J].中草药，2011,42(10)：1921-1924.

[6]陈育华，周克元，袁汉尧.山柰酚药效的研究进展[J].广东医学，2010,31(8):1064-1066.

[7]吴巧敏，金雅美，倪海祥.山柰酚对2型糖尿病大鼠慢性并发症相关因子的影响[J].中草药，2015,46(12):1086-1089.

[8]国家药典委员会．中华人民共和国药典(四部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015:202.

[9]吴琳琳，王芳，茅向军，等.青钱柳质量标准的研究[J].中成药，2017,39(4)：745-750.