廖欣　邹娟　黄安亮

[摘要] 目的 明确少见类型的宫颈癌患者HPV感染亚型种类，以期评估HPV疫苗对这组宫颈癌的预防效果。 方法 收集2014年9月～2017年9月就诊于四川大学华西二院的少见类型宫颈癌患者病例，HPV基因分型检测采用PCR和Luminex流式荧光技术进行，分析HPV感染情况及基因型分布，经计算特定HPV亚型的阳性比例来评价HPV亚型对宫颈癌的相对贡献。采用比例权重归因（PWA）方法将多重感染中亚型占比折算至相应的单型别感染。 结果 纳入病例143例，HPV阳性数为130例，阳性率90.91%，其中黏液腺癌60例（46.15%）、腺鳞癌46例（35.38%）、神经内分泌癌8例（6.15%）和混合类型16例（12.31%），其中单一感染109例（83.84%），多重感染为21例（16.15%），HPV16和18亚型为各组中占比最大的亚型，在黏液腺癌、腺鳞癌、神经内分泌癌和混合类型中分别是85.88%、93.39%、100.00%和83.32%。 结论 HPV16/18亚型是这组少见类型宫颈癌患者感染的主要亚型，九价疫苗对于本组宫颈癌的预防效果有一定提高。

[关键词] 基因分型；宫颈癌；黏液腺癌；腺鳞癌；神经内分泌癌；疫苗

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（c）-0085-04

[Abstract] Objective To provide more evidence for the estimation of potential impact of HPV vaccine， by analyzing the distribution of HPV genotypes in unusual types of cervical cancer. Methods From September 2014 to September 2017， in West China Second Hospital of Sichuan University， unusual types of cervical cancer were collected， HPV genotyping was done by use of PCR and Luminex fluorescence technique. Relative contribution of HPV types in ICCs was expressed as the percentages of type-specifc cases among HPV-positive cases. Multiple infections were incorporated into single infection using the method of proportional weighting attribution （PWA）. Results In the study， 143 invasive cervical cancer cases were included， and 130 （90.91%） cases were positive for HPV DNA， among them， 60 （46.15%） cases were adenocarcinoma （ADC）， 46 （35.38%） cases were adenosquamous cell carcinoma （ADSCC）， 8 （6.15%） cases were neuroendocrine carcinoma （NECA） and 16 （12.31%） cases were mixed type， 109 （83.84%） cases were present as single infections and 21 （16.15%） cases were present as multiple infections. HPV types 16 and 18 were the major types in each histological group. The PWA of HPV 16/18 to ADC， ADSCC， NECA and mixed type were 85.88%， 93.39%， 100.00% and 83.32%， respectively. Conclusion HPV 16 and 18 infections are predominant in these unusual types of cervical cancer. The 9-valent HPV vaccine has some improvement for prevention of these unusual types of cervical cancer.

[Key words] Genotype； Uterine cervical cancer； Adenocarcinoma； Adenosquamous cell carcinoma； Neuroendocrine carcinoma； Vaccine

浸潤性宫颈癌（invasive cervical cancer，ICC）是世界范围内女性第4常见的恶性肿瘤[1-2]，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）在宫颈癌的发生发展中起着关键作用，高危亚型HPV的持续感染是绝大多数ICC发生的必须因素[3-4]，而注射HPV疫苗是宫颈癌预防的有效措施[5-6]。目前，国内对于HPV感染与肿瘤相关性的研究大多数集中于宫颈鳞状细胞癌及其癌前病变中，对于其他HPV感染相关的组织学类型的宫颈癌，如黏液腺癌（胃型腺癌除外）、腺鳞癌、神经内分泌癌等的研究较少，单独针对这些类型宫颈癌HPV感染情况的研究则几乎没有。本研究对经病理确诊的143例非鳞癌类HPV感染相关宫颈癌石蜡包埋组织进行以PCR为基础的分型检测，旨在探讨HPV不同亚型和不同类型宫颈癌之间的关系，以期为HPV疫苗筛选和宫颈癌防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年9月～2017年9月四川大学华西第二医院收治并完成根治手术的143例宫颈癌患者，所有患者均完成病理学诊断，其石蜡标本经连续切片后仍保留有目标组织，且所有标本β-globin检测均为阳性。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者和/或家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 采用仪器为LifeECO基因扩增仪和Luminex 200多功能流式点阵仪（配套使用透景HPV专用分析软件）。试剂为上海透景人乳头状瘤病毒核酸分型检测试剂盒（流式荧光杂交法）

1.2.2 样本DNA提取 每例样本收集25～100 mg石蜡切片组织，采用组织基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作规程提取DNA模板待用。

1.2.3 PCR 扩增 每份PCR反应液包含10 μL预混液，5 μL引物混合液和0.8 μL聚合酶，充分混匀后瞬时离心，取15 μL加入PCR 反应板反应孔中，再取上清样本DNA模板、阳性质控和阴性质控各5 μL加入相应反应孔，混匀瞬离后再放入PCR仪进行扩增。扩增条件：95℃ 5 min，1个循环；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，5个循环；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 3 min。

1.2.4 荧光素微球杂交 在反应板杂交孔中分别加入22 μL微球杂交液和3 μL样本PCR扩增产物，混匀后封板，放入PCR仪中进行杂交。95℃变性5 min；48℃杂交30 min；每孔加入75 μL荧光标记的链霉亲和素-藻红蛋白，重新封板，48℃孵育15 min。

1.2.5 上机检测 将孵育好的杂交板转移至预热好的Luminex 200多功能流式点阵仪上进行检测和结果分析，具体操作流程和结果判读按试剂、仪器说明书进行。本研究检测27种HPV基因型，包括17种高危亚型（16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82）和 10种低危亚型（6、11、40、42、43、44、55、61、81、83）。

1.2.6 宫颈癌的病理学诊断 根据2014版世界卫生组织女性生殖器官肿瘤分类对入选病例进行组织学诊断和分类，分为黏液腺癌（非胃型）、腺鳞癌、神经内分泌癌和混合类型[7]。

1.2.7 观察指标及评价标准 通过计算特定宫颈癌亚型内HPV阳性患者中某单一HPV亚型阳性患者的比例来评价HPV亚型对该型宫颈癌的相对贡献。由于HPV存在多重感染现象，如逐个累计特定HPV亚型在单一感染和多重感染患者中出现的次数，总感染频次将超过总例数。在发生多重感染时，每个亚型HPV对肿瘤发生的相对贡献需要准确评估，Stoler等[8]的研究证实，在一个细胞中存在多个亚型HPV感染时，只有一种亚型发生转录并具有治病性。因此，Insinga等[9]提出在分析某种HPV亚型分布时除计算该亚型单型别感染次数/比例外，对多重感染患者采用比例权重归因（proportional weighting attribution，PWA）的分析方法，即将多重感染按同类型病变中相应单型别感染的比例折算为单个亚型感染的频次。例如，如果存在2例HPV16和HPV18二重感染患者，组中HPV16单型别感染和HPV18单型别感染分别占所有单型别感染的60%和20%，那么按比例权重归因计算HPV16感染的频次为1.50[2×60/（60+20）]，HPV10感染的频次为0.50[2×20/（60+20）]，最后计算所得2例总计感染频次仍然为2。本研究中对多重感染HPV病例采用了这种计算方法。

2 结果

2.1 组织病理学分型

在纳入的161例患者中，去除合并宫颈鳞状细胞癌癌前病变，即鳞状上皮内瘤变（CIN）的18例，实际纳入143例，其中HPV阳性为130例，阳性率为90.91%，年龄26～68岁，平均年龄45.76歲，中位数46岁，分别为黏液腺癌60例（46.15%）、腺鳞癌46例（35.38%）、神经内分泌癌8例（6.15%）和混合类型16例（12.31%），混合类型中神经内分泌+腺鳞癌7例（5.38%），神经内分泌+黏液腺癌9例（6.92%）。

2.2 HPV感染的一般情况

在130例HPV阳性患者中，检测出的HPV亚型共13型，其中高危亚型11型，分别为16、18、33、39、45、51、52、58、59、66和68；低危亚型2型，分别为43和55。HPV感染主要为单一感染，其中HPV单一亚型感染为109例（83.84%），多重感染为21例（16.15%），包括一例三重感染，其余均为二重感染，其中HPV66， 68均为混合感染。各组的多重感染率分别是黏液腺癌10例（7.69%）、腺鳞癌5例（3.85%）、神经内分泌癌3例2.31%和混合类型癌3例（2.31%）。见表1。

2.3 HPV各亚型在不同类型宫颈癌中的分布

采用PWA方法对混合感染亚型中各个亚型进行比例权重计算，其PWA占比详见表2。在各组中，除了神经内分泌癌组以HPV18为最常见感染亚型外，其余各类亚型均以HPV16是最常见亚型；而HPV16和18亚型为各组中占比最大的亚型，黏液腺癌占85.88%，腺鳞癌占93.39%，神经内分泌癌占100%，混合类型占83.32%。

3 讨论

HPV感染为绝大部分ICC发生的首要因素，注射HPV疫苗为预防ICC发生的有效措施。已知HPV病毒约有40种亚型与生殖道感染有关[10]，且在不同组织学类型的ICC中感染分布情况不同，而HPV疫苗不可能覆盖所有亚型，因此分析不同类型宫颈癌的患者人群的HPV感染情况可为HPV疫苗研制提供依据。同时，随着宫颈细胞学检查的广泛推广，鳞状细胞癌发生率有所下降[11-12]，但腺癌和神经内分泌癌等少见类型的宫颈癌发生率呈上升趋势[11，13]。故研究这类宫颈癌中HPV感染情况并进行针对性预防具有重要意义。

HPV16及18亞型为鳞状细胞癌及其癌前病变的主要感染亚型，约占70%[1，14-15]，其他类型如腺癌、神经内分泌癌等由于病例数较少，其数据较少，目前开发的疫苗能否发挥良好的保护作用还有待进一步评估。Li等[14]对全世界范围内文献报道的30 848例宫颈癌进行分析研究表明，对于鳞状细胞癌及其癌前病变，HPV感染的最常见亚型是16和18，所占比例分别是57%和16%，两者总占比73%。在另一项大宗的病例研究中，de Sanjose等[15]收集了来自38个国家10 575例的宫颈癌患者的石蜡包埋组织进行HPV分型检测，鳞癌HPV感染的最常见亚型也是16和18，所占比例分别是66%和7%，两者总占比73%。Pirog等[16]对760例（目前为止最大宗相关研究）宫颈腺癌肿瘤组织进行HPV检测发现，经典黏液腺癌（普通型）HPV阳性率为71.8%，其他类型HPV阳性率较低，HPV16、18及45是感染的主要亚型，占94.1%，16和18亚型占82.5%。Castle等[17]对143篇文献进行meta分析发现，大多数神经内分泌癌与HPV感染有关，85%小细胞神经内分泌癌和88%大细胞神经内分泌癌与HPV感染有关，其感染的主要亚型为HPV16和18亚型，这两种类型中单一感染亚型均为18型占优。在本组宫颈癌患者中，整体上HPV16及18亚型占比仍显著占优，与前述文献中报道的宫颈癌HPV感染情况一致，且在本文统计的4个非鳞癌的宫颈癌类型中，HPV16及18亚型的总占比高达83.32%～100%，提示HPV16/18感染依然是这些少见类型宫颈癌的主要致病因素，其权重甚至高于文献报道[14-15]的在宫颈鳞状细胞癌中的权重；在神经内分泌癌中，HPV18亚型占比高于16亚型，与文献[17]中报道相符。

不同亚型HPV编码外壳蛋白的基因变异很大，且HPV各亚型之间几乎没有交叉保护抗体，因此容易造成不同亚型HPV多重感染。目前有研究表明， HPV多重感染也是宫颈癌的高危因素，HPV多重感染可能会影响病毒的致病能力，并最终关系到宫颈癌病程的进展和严重程度[18-20]。Lee等[18]的研究表明，单一HPV感染使宫颈癌的患病风险增加19.9倍，而多重HPV感染使该风险增加到31.8倍。在de Sanjose等[15]的研究中，宫颈鳞状细胞癌的多重感染率为7%，在本组患者中，整体多重感染率为16.15%，其中侵袭性最强的神经内分泌癌高达37.50%，其余各组的多重感染率在各组中分别是黏液腺癌16.67%、腺鳞癌10.87%和混合类型癌18.75%。但多重感染率的差异是否与疾病类型有关，仍需更多病例及进一步的研究证实。

美国食品药品监督管理局（FDA）先后批准上市的HPV预防性疫苗有3种，分别为针对HPV16和18亚型的二价疫苗Cervarix、针对HPV 6、11、16和18亚型的四价疫苗Gardasil以及针对HPV 6、11、16、18、31、33、45、52和58亚型的九价疫苗Gardasil 9。本研究通过计算HPV二价疫苗、四价疫苗和九价HPV疫苗所针对的hrHPV亚型对这些类型宫颈癌的相对贡献，初步评估了这三类疫苗对本组的宫颈癌的预防作用。四价疫苗与二价疫苗相比，增加了6和11两个亚型，但这两个亚型的感染并未出现在本组病例中，故对于本组病例，该两类疫苗的预防效能基本相当。而九价疫苗针对的7种hrHPV亚型对本组宫颈癌的相对贡献较二价及四价疫苗有一定增长，其增长度分别是黏液腺癌10.59%、腺鳞癌2.17%和混合类型11.11%，在黏液腺癌和混合类型中提高最为明显，提示九价疫苗对预防这两种类型的宫颈癌的发生可能较二价及四价疫苗更为有效，对于腺鳞癌的预防作用也有所提升，但较为有限。本组患者中，还存在九价疫苗HPV亚型中没有覆盖的亚型，如39、43、59型，提示这类患者即使在接种九价疫苗后，这些少见类型的宫颈癌的发病风险仍不容忽视。

综上所述，非鳞癌类宫颈癌，其HPV感染亚型及感染模式可能与宫颈鳞癌有一定差异，九价HPV疫苗可能对这些类型的宫颈癌有更好的预防作用。但由于样本数量数量仍然有限，且只纳入了本院病例，故尚需多中心合作，以期获取更多地区样本数据进行综合分析比对，为HPV疫苗的研发提供更多理论依据。

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（收稿日期：2017-12-12 本文編辑：苏 畅）