冯 富，曲业鹏，马有智

(浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058)

生物被膜是一种附着于生物或非生物表面，包裹着由其自身产生的细胞外多聚基质、具有三维结构的细胞群体[1]，是细菌生长过程中为适应生存环境而在固体表面上生长的一种与游离菌相对应的存在形式[2]。据报道，细菌形成生物被膜存在免受外界伤害、营养条件丰富、细菌与细菌间形成共同体以及细菌自我编码的生存方式等多种诱因[3]。

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila，AH)在自然界中广泛分布，对水产动物、畜禽和人类均有致病性，可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻，往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失。近年来嗜水气单胞菌生物被膜引起了国内外学者的关注，已有研究将嗜水气单胞菌生物被膜作为口服疫苗[4]，而生物被膜形成影响因素方面鲜有报道。本研究采用生物被膜体外定量检测方法，探讨了时间、温度、Ca2+、Mg2+、葡萄糖以及人纤维蛋白原对嗜水气单胞菌生物被膜形成的影响，为制备生物被膜条件优化提供了数据参考。

1 材料和方法

1.1 材料

嗜水气单胞菌AH-X由浙江大学水产动物健康养殖实验室提供；TSA培养基、BHI培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；LB培养基按常规使用方法配制；人纤维蛋白原购自上海生工生物技术有限公司。

1.2 生物被膜的形成与测定

生物被膜制备与定量检测参考Stepanovic等[4-5]的96孔板法并加以改进，具体步骤如下：菌悬液与培养基按1∶100体积混合均匀后取200 μL加入到96孔细胞培养板小孔中，25 ℃(或37 ℃)静置培养后弃去培养液，用生理盐水250 μL清洗3次以去除游离菌，55 ℃烘箱干燥后往各孔加入200 μL甲醇，固定15 min，室温干燥；……