赵昌永

一、高效液相色谱的发展史

1.HPLC的前奏和萌芽

1903年，俄国植物学家茨维特（Tsweet）发表了“一种新型吸附现象及在生化分析上的应用”的研究论文，文中第一次提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。称之为色谱法。

马丁（Matin） 和辛格（Synge）用一根装满硅胶微粒的色谱柱，成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的有效分离，建立了液液分配色谱方法。

2.HPLC的建立和逐步完善

第一届液相色谱会议1973年在瑞士的因特拉肯举行，现在则称之为HPLC73。哈恩和汉卡克以及他们的同事于1975年开创了生物高分子分离。

我国于70年代初，科学院大连化学物理研究所就开展了HPLC的研究，與工厂合作生产出了液相色谱固定相，并出版了论文集，编写了高效液相色谱讲义。

二、高效液相色谱分类、特点、原理、系统

1.高效液相色谱的分类及特点

高效液相色谱可依据溶质（样品）在固定相和流动相分离过程的物理化学原理分为五大类：

一是吸附色谱，二是分配色谱，三是离子色谱，四是体积排阻色谱，五是亲和色谱。

高效液相色谱具有以下特点：

一是分离效能高。由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱的柱效达2×103～5×104/m理论塔板数。

二是选择性高。由于液相色谱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱不仅可以分析不同类型的有机物和同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体。

2.高效液相色谱的原理及系统

高效液相色谱法是在经典液相色谱法基础上发展起来的。高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离[4]。

高效液相色谱的系统：

高效液相色谱仪的主要部件有：贮液罐、高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器等。其基本的工作流程是：贮液罐中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相中，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程后，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

三、高效液相色谱在各方面的应用

高效液相色谱适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质，它们约占全部有机化合物的80%。现在高效液相色谱已在制药业研究中、食品工业分析中、环境监测、精细化工产品分析和生物化学及生物工程中获得广泛的应用。

1.在药业研究中的应用

高效液相色谱在药物分析中，主要考虑试样的预处理和分析柱、检测器的选择，在试样的预处理上，日前兴起的固相（微）萃取使得许多含量低的成分得到精制提纯，从而适于高效液相色谱[5]的测定。

青霉素有效成分的分离可采用反相键合相色法。色谱柱为Partisil-10 ODS，流动相：0.25摩尔每升碳酸铵水溶液，流量1.43毫升每分钟。生物碱是从植物中提取获得的含氮有机化合物，其种类繁多，大多数具有特殊的镇痛生理作用，已在临床上广泛使用。

2.在食品工业分析中的应用

黄曲霉素是贮存时由真菌产生的毒素，它们是一类稠环类固醇化合物，有致癌作用。花生中的黄曲霉素可用正相吸附色谱分析，分析前，样品先用甲醇、氯仿、己烷、丙酮和乙酸乙酯等溶剂，经机械震荡30分钟进行浸泡，经浓缩、精制后进行分析。色谱柱为硅胶，流动相为氯仿和二氯甲烷，流量为0.5毫升每分钟。使用荧光检测器检测，激发波长为365 nm，发射波长为408 nm[6]。

食品中糖含量是产品质量控制的一个指标。糖类可以分为单糖、寡糖和多糖，它们可以用离子交换柱或氨基键合相柱进行分离。色谱柱为胺丙基硅胶柱，流动相为75%乙氰水溶液；流量为2.0 mL/min。用UVD（188 nm）进行检测。

食品中的有机酸和酸味剂是食品酸味和鲜味的重要成分，也对食品的防腐起到重要作用。其中，咖啡酸及其衍生物可用反相键合相色谱进行分离。色谱柱为Li SI-C18 ，流动相为20%乙酸水溶液，流量为4.5 mL/min，用UVD检测。

3.在环境监测中的应用

高效液相色谱在环境监测中已得到广泛应用。EPA列出11项酚类化合物。均是焦化、染料、造纸、化工等工业废水的主要衍生物，污染范围很广，对环境危害极大。HPLC测定酚类化合物，可以保持酚类化合物组成不变，对各种不同取代基及不同结构的酚类可以同时进行分离和分析，且具有重现性好、灵敏度高、选择性好的优点。

4.在精细化工产品分析中的应用

在精细化工生成中使用的具有较高分子量和较高沸点的有机物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醚、醛和酮、酸等化工原料，以及各种表面活性剂、药物和染料等，都可以使用高效液相色谱进行分析。

使用凝胶渗透色谱柱分析聚乙二醇，色谱柱为AD-803/S，流动相为二甲基甲酰胺，流量1.0毫升每分钟，柱前压为1.0 Mpa，柱温为62℃，用示差折光检测器检测。

5.在生物化学及生物工程中的应用

当前随着生命科学和生物工程技术的迅速发展，人们对氨基酸、多肽等生物分子的研究兴趣日益增加。这些生物活化分子是人类生命延续过程必须摄取的成分，也是生物化学、生物工程中重要研究对象。

四、高效液相色谱的展望

高效液相色谱法是吸纳了经典液相色谱法和气相色谱法的优点进行改进和发展起来的现代分析方法，具有分离速度快，测定效率高，重现性好的特点。目前指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。国外也运用HPLC联用技术在植物药鉴别中。同时也是探索人类基因组DNA序列变异的新手段。可以预计，随着研究工作的深入，高效液相色谱必将很快成为广泛采用的新的色谱方法。