我国金银花分子生物学研究进展

2018-05-14董薇

安徽农业科学 2018年2期

董薇

摘要综述了DNA条码、分子标记、液相色谱技术等分子生物技术在金银花中的应用，并简述了金银花组培快繁技术、金银花功能基因克隆情况，为更深入地开展金银花研究奠定理论基础。

关键词金银花；组培快繁技术；分子生物技术；基因克隆

中图分类号 S567.7+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）02-0015-04

Abstract The application of molecular biology techniques such as DNA barcodes，molecular markers and liquid chromatography techniques in Lonicera japonica was reviewed.The rapid propagation of Lonicera japonica tissue culture and the cloning of functional genes of Lonicera japonica were briefly described，which lays a theoretical foundation for the further study of Lonicera japonica.

Key words Lonicera japonica；Rapid propagation technology of tissue culture； Molecular biology technology；Gene cloning

金银花（Lonicera japonica）为忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物[1]。金银花的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、凉散风热的功效，为常用的大宗中药材。中国各省均有分布，种植区域主要集中在山东、陕西、河南、河北、湖北、江西、广东等地。分子生物手段在金银花中的应用虽然较晚，但已经在金银花快繁、金银花鉴定等方面取得了显著成果。为今后更深入地开展金银花研究，笔者对分子技术在金银花研究中取得的进展进行了综述。

1 金银花组培快繁技术

脱毒和离体快繁是植物组织培养应用最多、最广泛和最有效的一个方面。脱毒苗具有无杂菌、适应能力较强、繁育较快、质量优、抗性好等优点。近年来，金银花脱毒快繁、工厂化育苗有很大的发展。金银花不同部位的外植体在金银花组培快繁中均有应用，但诱导率不同，幼叶最易诱导愈伤组织[2]，易灭菌且萌发力强的当年嫩枝也可以成功诱导[3-5]，外植体木质化和半木质化茎段以4～6 mm为宜，未木质化和顶芽茎段的大小以操作方便为宜[6]，顶芽通过诱导生芽、增殖培养、诱导生根，也可以得到金银花幼苗[7-8]。

诱导增殖培养基一般是以MS培养基为基础培养基，添加激素种类有6-BA、2，4-D、NAA、IBA、IAA、KT等，诱导幼叶愈伤使用MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L[2]，诱导顶芽外植体愈伤组织选择最优培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA[3]。杨冬业等[5]使用MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.01～0.05 mg/L进行不定芽的诱导，诱导率为100%；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01～0.05 mg/L 适合继代壮苗培养；1/2 MS+IBA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 适合金银花的生根诱导培养。王文静等[7]研究发现，诱导红金银花顶芽生芽培养基为MS+KT 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+α-NAA 0.1 mg/L，增殖培养基为MS+KT 1.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+α-NAA 0.3 mg/L，生根培养基为1/2 MS+α-NAA 2.0 mg/L + IAA 0.15～0.20 mg/L。刘敏杰[8]分析得出，以金银花的芽尖诱导丛生芽培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖培养为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，生根培养基为1/2MS+IBA 3.0 mg/L+0.15%活性炭培养基。赵先海等[4]研究表明，适合诱导的培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L；较好的增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，芽健壮整齐，增殖系数可达4.5左右；较好的生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L，生根率达90%以上。任斌[9]以金银花试管苗带腋芽茎段为外植体，研究指出金银花经腋芽扩繁的最佳培养基为B5+NAA 0.05 mg/L+BA 2.0 mg/L+GA 31.0 mg/L，繁殖系数达4.1；另外研究萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和多效唑（MET）对组培苗生根的影响，不同浓度的激素配比对组培苗根系指标影响不同，结果表明，生根率、主根数、须根数为统计指标最佳培养基配比中激素浓度差别很大[10]。

金银花的组织培养中，防止组织褐变是培养成功的关键技术之一。王鹏等[6]研究表明，0.1% Vc和0.3%活性炭在红金银花的组织培养中可有效地防止外植体组织褐化；2 mg/L 6-BA 易引发褐变，2 mg/L KT 和2 mg/L α-NAA 對组织褐变影响与对照相比差异不大；采用仿自然气候（20 ℃-1 500 lx-4 h-85%→25 ℃-2 000 lx-8 h-85%→20 ℃-1 500 lx-4 h-85%→18 ℃-0 lx-8 h-85%）培养可有效抑制褐变的发生。

2 分子生物技术在金银花鉴定中的应用

2.1 DNA条码在金银花鉴定中的应用

DNA分子鉴定技术用于物种鉴定具有准确可靠、重复性高等优点。以ITS2为主体的中药材DNA条形码鉴定新方法体系和数据库平台已获准纳入《中华人民共和国药典》。宋雯舒等[11]提取金银花、山银花对照药材及河北和山东产地金银花样品DNA，检测DNA浓度和纯度，采用基于聚合酶链式反应（PCR）方法的DNA分子标记技术鉴别样品。崔志伟等[12]研究ITS2和psb A-trn H作为鉴定金银花不同品种的优势条形码组合，不同品种金银花ITS2和psb A-trn H序列的扩增成功率为100%，测序成功率分别为72.7%、91.0%，且两者均存在较多的变异位点。胡凯等[13]探讨Bar-HRM联用技术在金银花及山银花药材鉴别中的应用，发现利用psb A -trn H 序列设计引物，HRM 曲线能够区分不同的金银花和山银花药材品种，Bar-HRM能在金银花类药材混合物中检测出低至5%的山银花样品，说明Bar-HRM在金银花及山银花药材品种的分类、鉴别上具有可靠的分辨能力，适用于金银花及山银药材掺混的快速鉴定，能够实现一管式闭合分析。

2.2 分子标记在金银花鉴定中的应用

利用简单有效的方法鉴定药用植物种及其变种一直是中药材鉴定首先要解决的问题。EST-SSR多态位点多，信息量大，遗传变异信息丰富，并且检测快速、稳定，常用来鉴定药材品种。蒋超等[14]通过生物信息学手段对实验室保存的忍冬及其变种红白忍冬（L.japonica var. chinensis Thunb.）EST序列进行分析，共获得3 705条忍冬EST-SSRs，2 818条红白忍冬 EST-SSRs；分析结果表明，金银花及其变种红白忍冬主要SSR重复为二核苷酸，其次为三核苷酸，主要重复基序类型为AG/TC和GAG/TCT；通过同源比对，在忍冬及其变种中共筛选出87对重复次数具有差异的EST-SSR；选出15对碱基数差异大于6的EST-SSR进行验证，结果表明其中的13对引物在52份金銀花类药用植物中具有有效扩增产物，且引物Jp.ssr4、Jp.ssr64及Jp.ssr65可用于忍冬及其变种、山银花原植物的鉴别。徐石勇等[15]以金银花及其常见变种为材料，利用SSR标记技术构建分子指纹图谱，并用于遗传多样性分析；选择25个SSR位点用于多态性分析，其中3个位点具有较强多态性，并构建基于Excel格式的金银花SSR指纹图谱，包括3对引物在6个供试材料中扩增到的18条多态性条带信息；应用该指纹图谱对金银花及其变种的遗传多样性进行分析，结果表明，金银花与山银花之间遗传距离较远，仅0.28；应用该指纹图谱对87个市售金银花进行分析，能够区分出河北、山东、河南等地的金银花品种。

ISSR分子标记能够灵敏地揭示2个亲缘关系十分相近个体之间的差异，可以应用于金银花样品间遗传多样性分析，分析金银花种内不同地域或不同植物来源的材料间存在的遗传差异，为金银花的种质资源鉴定、遗传关系分析及栽培育种提供分子生物学依据。王湘莹等[16]采用ISSR标记技术从100个引物中筛选出10个重复性高、扩增效果好的引物，对23个金银花品种的样本进行PCR扩增，23个金银花品种间的遗传相似系数为0.471 3～0.100 0，平均遗传相似数为0.629 9，平均基因多样度（He）和Shannon多样性指数分别是0.379 3和0.556 3，表明品种间的遗传基础较宽及遗传多样性较高；聚类分析（UPGMA）表明，23个供试金银花品种划分为忍冬、美国忍冬、灰毡毛忍冬3大类。韩琳娜等[17]应用ISSR分子标记技术对三大道地产区的27个金银花原植物种质资源进行遗传多态性、相似性和聚类分析，筛选出16个多态性引物，获得344条带，多态性比率为88.4%；遗传相似系数为0.50～0.90；聚类分析表明，27个品种被分为2个类群。孙稚颖等[18]对采自金银花主产区的18农家品种及野生忍冬和近缘种灰毡毛忍冬共计36个样品进行ISSR-PCR分析，采用NTSYS-pc软件计算金银花不同农家品种及近缘种间的Jaccard遗传相似系数，按非加权配对算术平均法（UPGMA）建立所研究类群的系统聚类图；使用12条引物共扩增出129个条带，其中多态带为114条，占总扩增条带数的88.37%；从聚类分析图可以看出，金银花不同样本首先聚在一起，表明是一自然类群；野生忍冬与栽培品种具有明显的遗传差异；主产区传统品系毛花系列遗传相对较稳定，而鸡爪花系列品种繁杂，遗传变异大；新品种九丰一号已独立成一稳定品种。

RAPD分子标记已经在作物品种或种子纯度鉴定方面广泛应用，这种检测方法简便快速，但是存在条带稳定性差、饰演重复性低等问题[19-22]。为了保证检验结果的准确性和可重复性，可以采取保证反应条件一致，多次重复每个引物，放弃重复性低的模糊条带，统计稳定出现、重复性高的条带并进行遗传分析。王一斐等[19]利用RAPD分子标记技术对胶东地区31个金银花品种的遗传多样性及遗传关系进行研究，聚类分析结果表明，31个金银花品种可以分为两大类：采自昆嵛山太白顶的金银花品种为一类，其余30个金银花品种为一类；从遗传距离来看，采自昆嵛山太白顶的品种与中医世家引进金银花品种大毛花遗传距离最远，为2.507；采自龙口兰高镇马蔺塂（Ⅱ）与中医世家引进金银花品种四季丰遗传距离最近，为0.020；不同金银花种源间具有较高的遗传多样性，不同金银花种源间的遗传关系与地理分布有一定的相关性。

2.3 液相色谱技术在金银花鉴定中的应用

高效液相色谱（HPLC）法具有分离效率高、速度快、灵敏度高、稳定性和可重复性好、流动相选择性广、检测器种类多、色谱柱可反复使用等特点，现已成为研究中药指纹图谱的重要手段之一。赵君峰等[23-24]采用HPLC法测定10个不同商品来源的金银花样品，建立川渝地区金银花药材甲醇溶解部分的HPLC指纹图谱；色谱条件为C18柱，甲醇-1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，检测波长237 nm，体积流量1.0 mL/min，柱温30 ℃；该方法能够很好地分离川渝地区金银花的主要成分；不同产地金银花药材指纹图谱相似度较好，建立了含有11个特征指纹峰的川渝地区金银花标准指纹图谱。杨欣欣等[25]采用指纹图谱技术对不同产地金银花药材进行分析比较，采用Agilent TC-C18色谱柱，流动相为0.5%冰醋酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱，波长为327 nm，对14种不同产地金银花药材进行测定，建立金银花药材指纹图谱，并确定14种不同产地金银花药材的18个共有峰，且14种金银花药材的指纹图谱相似度为0.9以上；不同产地金银花药材的指纹图谱存在明显差异，又存在一定程度的相关性。何兵等[26]以绿原酸为参照物建立金银花HPLC指纹图谱，同时以斜率校正法建立绿原酸与其余8个成分（新绿原酸、隐绿原酸、当药苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C）的相对校正因子，计算其含量，实现一测多评；同时采用外标法测定该9个成分的含量，并比较二者的差异；建立了金银花HPLC特征指纹图谱共有模式，标定了21个共有峰，指认了其中9个共有峰，20批金银花的相似度为0.959～0.997；20批金银花中9个成分的计算值与实测值间无显著差异；验证了一测多评法的准确性和可行性。黄海燕等[27]通过指纹图谱比较金银花和山银花的质量，对50批样品进行指纹图谱分析，木犀草苷分析系统说明金银花与山银花有共同的有效成分物质基础，该系统指纹图谱不能区别具体品种；皂苷分析系统中不同品种的指纹图谱有较明显的区别，可用于金银花与山银花具体品种的鉴别参考。宋雯舒等[11]以绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙为指标成分，利用HPLC测定指标成分含量，结果发现，河北和山东产地金银花中绿原酸质量分数为3.1%～3.3%，河北、山东产地金银花中木犀草苷质量分数分别为0.049%～0.050%、0.069%～0.078%。

韩永成等[28]采用UPLC指纹图谱方法，Agilent C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流动相乙腈-0.2%磷酸水，以0.4 mL/min的流速进行梯度洗脱，检测波长238 nm，柱温30 ℃；在21 min内得到金银花药材的指纹图谱，对其中5个色谱峰进行了初步归属，并对14批药材样品进行了分析，其相似度为0.915～0.987。UPLC指纹图谱方法较HPLC大大缩短了分析时间。

3 金银花功能基因克隆情况

基因克隆是分子育种的基础。吴敏琳等[29]以不同产地及品种的金银花为材料，通过RT-PCR法扩增其HQT基因编码区，直接测序，发现HQT基因编码区变异包括碱基置换突变、插入/缺失突变，部分变异会引起HQT蛋白的改变，并影响绿原酸的表达量。蒋向辉等[30]采用RT-PCR和RACE技术，首次从金银花中克隆丙酮酸激酶基因全长cDNA，命名为LiPkc（GenBank登录号JQ621946.1），LiPkc基因编码区序列全长为1 533 bp，共编码510个氨基酸；基于基因序列亲缘关系分析结果显示，LiPkc基因与烟草Pkc基因亲缘关系最近，属于双子叶植物Pkc基因家族；蛋白质亚细胞定位分析认为LiPkc在线粒体或叶绿体中发挥作用；LiPkc蛋白质的三维空间结构预测结果显示，LiPkc蛋白主要由α-螺旋、不规则盘绕组成；定量PCR检测发现，LiPkc基因在金银花不同组织中广泛表达，但表达水平各有差异，黄花中表达量最高。刘霞宇等[31]选取金银花的9个候选内参基因Lonja.ACT11、Lonja.ACT2/7、Lonja.G6PD、Lonja.GAPDH、Lonja.MTP、Lonja.TUA、Lonja.UBQ10、Lonja.EF1A、Lonja.UBC，利用q RT-PCR技术及Ge Norm、Norm Finder软件对它们的表达稳定性进行分析评价，得出可选用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD组合作为内参基因。乔中全等[32]根据已知的其他物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物，用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分cDNA序列，再用RACE技术获得其两端序列；序列拼接得到完整的1 248 bp的黄酮醇合成酶基因，根据获得的序列，设计引物扩增获得1 001 bp的开放阅读框，编码333个氨基酸；序列分析显示，金银花黄酮醇合成酶基因与烟草、马铃薯和桔梗的黄酮醇合成酶基因具有高度同源性。亓希武等[33]在药用植物金银花中克隆得到1条肌动蛋白（Actin）基因序列，命名为Lj Actin （Gen Bank 登录号：KY114518），序列比对结果表明，金银花的Actin和其他植物的Actin在序列上高度保守；进化分析结果表明，金银花的Actin与拟南芥的At ACT7和水稻的Os ACT2聚为一支；RT-PCR结果显示，Lj Actin在金银花5个不同发育时期的花中表达稳定。汪周勇等[34]从忍冬（Lonicera japonica Thunb.）轉录组测序结果中分析获得1个Fat B基因，分别以忍冬、红白忍冬[Lonicera japonica Thunb.var.chinensis （Wats.） Bak.]、红腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）和水忍冬（Lonicera dasystyla Rehd.）新鲜花蕾为材料，利用RT-PCR技术克隆获得了LJFat B、LHFat B、LJCFat B、LDFat B基因的全长cDNA，并进行生物信息学分析，结果表明，LJFat B、LJCFat B、LHFat B 和LDFat B 与拟南芥At Fat B具有较近的亲缘关系；LJFat B、LJCFat B、LHFat B和 LDFat B的核苷酸序列、蛋白特性及其二级结构有所差异，但其蛋白均具有保守的Fat B底物结合位点和催化活性位点，且在花蕾中的转录水平没有显著差异；因此推测LJFat B、LJCFat B、LHFat B 和 LDFat B 可能具有与At Fat B相同的生物学功能。莽草酸/奎宁酸香豆酰转移酶（HCT）是金银花中绿原酸合成途径的关键酶。何柳等[35]利用已经获得的金银花大量表达序列标签（EST）数据，通过cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆金银花HCT（LiHCT）基因。蒋向辉等[36]采用设计简并性引物和RACE克隆相结合，从金银花中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长，命名为LjCad（Gen Bank登录号：JQ621945.1）；基因全长为960 bp，开放阅读框为798 bp，其编码265个氨基酸，基因不含内含子，属于光系统Ⅱ的Cab基因；LjCad基因受光、6-BA、GA3和NAA诱导表达，但是黑暗和ABA激素处理对LjCad基因的表达没有明显的影响。齐琳洁等[37]通过生物信息学的方法从金银花转录组中获得4个DNA去甲基化酶基因，分别为LJDME1、LJDME2、LJDME3和LJDME4，并预测其编码蛋白的理化性质和表达模式；系统进化树结果表明，LJDME1、LJDME2聚为一类，LJDME3、LJDME4聚为一类，与拟南芥中的DME关系更为密切；基因表达分析表明，4个DNA去甲基化酶基因在变种间差异表达明显，LJDME1、LJDME2基因表达水平在红金银花中高于金银花，推测其可能参与调控金银花活性成分积累的过程，并且4个DNA去甲基化酶基因具有组织表达特异性。

4 我国金银花研究中的问题和建议

金银花药用价值和保健用途广泛，需求量不断增加，种植面积不断扩大。分子生物技术在金银花繁殖、育种、分类、鉴定等方面的研究取得了一定进展，尤其是鉴定方面，现在已拥有DNA条码、HPLC指纹图谱等快速、稳定、高效的金银花种间、种内鉴定技术。但与其他植物相比，金银花的分子生物研究仍处于起步阶段，如金银花快繁研究没有一套成熟的体系，关于金银花遗传图谱构建、功能基因研究较少。在今后的金银花研究中，一方面要在现有常规育种基础上解决金银花生产中的低产、染病等问题，同时分子生物辅助育种方面，如寻找绿原酸、木犀草苷紧密连锁的分子标记或生化标记，克隆关键基因同步开展，以期更快地促进我国金银花科学研究的发展。

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