苏玲

摘要 果皮颜色是影响葡萄及葡萄酒品质的重要指标之一，也是果实成熟过程中最明显的变化之一。类黄酮物质，特别是花色苷的合成对果实颜色具有至关重要的作用，它们的合成受到结构基因和调节基因的控制。从花色苷的生物合成途径展开，阐述了结构基因的种类、表达特性，调节基因的所属家族、调节特点等方面，特别介绍了MYB基因家族对结构基因的调控，以期为葡萄的颜色合成机理研究提供理论依据。

关键词 葡萄；果皮颜色；花色苷；结构基因；调节基因

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）02-0019-04

Abstract The skin color is not only one of the important indexes affecting the quality of grape and wine， but also one of the most obvious changes in fruit ripening process. The synthesis of flavonoids， especially anthocyanin， which is vital to the color of grape berry， is controlled by structural genes and regulatory genes. This paper started with the biosynthesis pathway of anthocyanin， elaborating the types and features of structure genes， families and regulation characteristics of regulatory genes， specially introduced the MYB gene family regulating structural gene in order to provide theoretical basis for the grape color synthetic mechanism.

Key words Grape；Berry skin color；Anthocyanin；Structural genes；Regulatory genes

葡萄是葡萄科葡萄屬落叶藤本植物，是主要的栽培果树品种之一。随着葡萄不同品种间的杂交和人工选择，果皮颜色的种类也越来越丰富。果皮颜色是影响葡萄及葡萄酒品质的重要指标之一，也是果实成熟过程中变化最明显的指标之一。类黄酮物质，如花色苷和黄酮醇，都对果皮和葡萄酒的颜色至关重要，并且可提高两者的感官品质[1-2]。类黄酮物质是植物次生代谢过程中的重要产物，广泛存在于果实、花和叶片等器官中。它不仅在植物抵御紫外线、病原菌等伤害时具有至关重要的作用，而且能够增加对授粉昆虫的吸引力[3-4]。此外，前人研究结果表明类黄酮物质还具有极强的抗氧化能力，可以预防心血管疾病和消除自由基[3]。

葡萄果皮颜色主要是由花色苷的比例所决定的，不同品种间花色苷类型不同，而且花色苷含量也有极大差异[5-6]。花色苷作为分子结构复杂的物质，是同时具有酸性集团和碱性集团的高分子共轭体系，它的生物合成与积累除受遗传特性、糖积累水平、激素水平、成熟期等内部因素的影响外[7-8]，还受光照、温度、水分、土壤及栽培管理措施等外部环境因素的影响[9-13]。人们通过对玉米、金鱼草和矮牵牛等物种中花色苷的生物合成和调控机理的研究，对植物花色苷有了较多的认识。在此基础上，研究者对葡萄花色苷的生物合成和调控研究也取得了较大的进展，通过对调控果皮颜色的相关基因的阐述，能够更加了解葡萄果皮中物质的代谢机理，以期为葡萄的开发利用和育种提供依据与工作基础。

1 葡萄花色苷生物合成途径

葡萄中花色苷主要的合成部位是在表皮细胞的细胞质中，经一系列运输途径最终在液泡中积累[14]。花色苷的生物合成在一系列酶催化下完成，整个过程中涉及20 多步反应[15]，它也是植物体类黄酮途径的分支之一，与原花青素（proanthocyanidins）和黄酮醇（flavonol）的合成拥有共同的上游途径[16]。花色苷的合成途径主要有以下几个阶段：第一阶段是苯丙氨酸代谢途径，它是由苯丙氨酸转化为香豆酰CoA，参与的酶有苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸羟化酶（C4H）和香豆酰CoA连接酶（4CL）等，此途径是很多次生代谢共有的；第二阶段为类黄酮途径[16]，由香豆酰CoA转化为黄酮类物质，此途径主要在查尔酮合成酶（CHS）、异构酶（CHI）、烷酮-3-羟化酶（F3H）、烷酮醇还原酶（DFR）、氢黄酮醇还原酶（DFR）和无色花色素双加氧酶（LDOX）等的催化下完成（图1）。经过上述2个阶段的反应，花色素的合成骨架基本形成，再经过甲基化、酰基化等修饰作用后，可以形成不同结构的花色苷。最后，内质网中的花色苷在谷胱甘肽-S-转移酶（GST）作用下与谷胱甘肽结合，经跨膜运输到液泡积累[2，4，15，17-18]。

目前研究发现，类黄酮生物合成有2类基因参与：一类是编码反应途径中各种酶的结构基因；另一类是控制结构基因表达的调节基因[1]。

2 编码反应途径中各种酶的结构基因

目前在葡萄类黄酮生物合成途径中主要有以下几种结构基因（表1）。

2.1 PAL基因

编码苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）。在葡萄中，PAL成员有 15～20 个[19]。它在葡萄的各个组织器官中均有表达，不具有组织特异性，但是不同品种间差异较大，在有色果实中均有表达[20-21]。葡萄果实发育过程中，PAL在果皮中的表达具有时空特异性，花后15～30 d表达量很高，之后表达减弱或不表达，在果实成熟时表达量最高[20，22]。

2.2 CHS基因

编码查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS），是最先被克隆的类黄酮合成基因，目前在“赤霞珠”葡萄中已经分离得到3个CHS基因，分别为CHS1、CHS2及CHS3。生物信息学研究表明CHS1和 CHS2有较近的进化关系，但是CHS3与二者进化关系较远[17]。在葡萄的组织和器官中，不同的CHS 家族成员的表达模式也不尽相同，CHS1和CHS2在葡萄叶片和果皮中都能检测到它们的表达，但是CHS3主要在葡萄转色后的果皮中特异表达[8，17]。此外，也有研究表明，在转色后CHS2也有表达，但是未检测到CHS1的表达[23]。一些学者认为CHS是花色苷形成的真正开始，是进入黄酮类合成途径的第一个限速酶，它在果实生长发育过程中一直保持着较高的活性[14，23-24]。

2.3 CHI基因

编码查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI），在葡萄中，已发现的CHI基因序列是CHI1和CHI2[23]。试验结果表明，CHI在葡萄的不同组织和器官中都能检测到表达，表达模式表现为非组织特异性，同时检测其在果实发育过程中的表达特性，发现表达量为先上升后下降后又上升的趋势，具体表现为花后15～30 d表达量上升，随后减弱，到葡萄转色期表达又加强[20]。

2.4 F3H基因

编码黄烷酮3-羟基酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H），在植物中，F3H既可以独立表达，又可以与其他结构基因协同表达。葡萄中F3H位于4号染色体上，主要在花后14～28 d的果皮中表达，表达规律基本表现为先加强再减弱，至转色后再加强[20，25]，并且研究结果表明其在红色品种成熟的果皮中表达高于白色品种[17]。F3H分别和F3′H（flavonoid 3′-hydroxylase，F3′H）、F3′5′H（flavanone 3′，5′-hydroxylase，F3′5′H）参与调控花色苷合成的2个分支。F3′H 和F3′5′H分别属于P450的CYP75B和CYP75A家族。在葡萄中存在4个F3′H 基因，Southern试验证明了它们为2对等位基因[26]。葡萄中F3′H和F3′5′H的表达模式存在较大的差异，但都具有时空表达特异性。F3′H的表达贯穿整个葡萄发育过程，高峰期为转色前，而F3′5′H仅在有色葡萄品种的果实成熟期表达，且发育早期表达微弱[2，14，26]。

2.5 DFR基因

编码黄烷酮醇-4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR），它在葡萄中是单拷贝的基因[27]。在葡萄中，DFR的表达不仅具有品种特异性，而且有很强的组织特异性，有色品种中的表达量显著高于无色品种，营养组织（如叶片）的表达量很高，但是在果皮中表达相对较低，在整个生长发育周期中，表现为早期表达量上升，随后下降，到转色后又再次上升的趋势[2，14，20]。

2.6 LDOX基因

编码无色花色素双加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX），LDOX 和DFR基因类似，也是单基因拷贝，并具有组织特异性，在根尖、叶片、花和种子中表达量较高，果实中较低，但其发育期间的表达量也遵循先上升后降低，转色后再上升的表达模式[2，20]。此外，LDOX的表达水平受光、Ca2+及蔗糖等因素的影响较大[28]。

2.7 UFGT基因

编码类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（UDP glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT），又被称为 3GT 或5GT，被认为是葡萄果皮花色苷生物合成途径中最关键的酶，分析发现欧亚种葡萄只含有3GT，而其他种群葡萄还包含5GT[27，29-30]。UFGT作为葡萄果实颜色形成的关键基因，已被研究得较为透彻，是目前已知的与转录调控最直接相关的结构基因。研究结果表明，它虽然在有色葡萄果实成熟期的果皮中特异表达，但是其转录和翻译除了受基因型和生理状态等内部因素的影响，外界环境如光照、温度等对其表达也有很大的影响[2，14，17，20，25]。

2.8 OMT基因

编码O-甲基转移酶（O-methyltransferase，OMT），对OMT表达的研究发现，其表达量与花色苷的含量呈正相关，在果实转色前没有表达，转色后开始有表达[1，14]。

2.9 GST基因

編码谷胱甘肽S-转移酶（glutathione Stransferase，GST），它是启动谷胱甘肽结合反应的关键酶。葡萄果实发育过程中，主要在转色后的果皮中[30]。此外，还发现GST的表达量在水分胁迫环境中明显上升[1，14]。除 GST 外，一些多药抗药性的相关蛋白（multidrug resistanceassociated protein，MRP）和多药有毒化合物排出家族（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）也参与了花色苷的转运[31-32]。在葡萄中，关于花色苷合成后的转运是近年研究者关注的难点和热点。

目前，研究发现MATE基因AM1、AM2和AM3成员参与花色苷的转运，也有报道指出 ABC 转运蛋白可能也参与花色苷的运输[33-34]。葡萄果实的颜色，一方面是由花色苷合成决定的，另一方面是由花色苷被有效地运输到液泡积累量所决定的。在葡萄中，关于花色苷合成后分子转运机制的研究较少，还需要进一步研究。

3 控制结构基因表达的调节基因

调节基因的作用机理是与结构基因上游的识别区域结合，调控其表达水平，以此启动或调控花色苷合成的各个途径[38-39]。目前的研究结果表明，调控基因的类型主要是几种编码转录因子蛋白的基因家族，例如 MYB、bHLH、WD40、WRKY、锌指（zinc finger）和同源异形结构域（homeodomain）等[4，16，40-42]。前人研究也表明，调节基因在黄酮醇和原花青素的合成过程中也发挥着重要作用[8，16，43]。研究者对调节基因的观点有很多，一些研究者把调节基因分为2类：一类是调节 PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、LDOX等结构基因的转录，它们的表达主要在果实发育早期；而另一类是促进 UFGT等结构基因转录，它们的表达主要在成熟期。另一些研究者认为2类调节基因分别是特异地调节UFGT在果实发育晚期表达和调节除UFGT以外的基因表达的基因[20，44]。

对葡萄、白杨和苹果等很多木本植物的研究表明MYB调控花色苷的生物合成。在葡萄中，调控花色苷生物合成的MYBA类基因已经被鉴定出来，酿酒葡萄（Vitis vinifera）存在VvMYBA1、VvMYBA2，然而，Vitis ×labruscana基因組有VlMYBA1-2、 VlMYBA1-3和VlMYBA2这3个功能性的基因[35，45]。研究表明MYBF1与FLS表达密切相关。此外，大量的研究表明MYB5a、MYB5b、MYBPA1和MYBPA2也是参与调节花色苷生物合成途径的基因[36，44，46-47]（表2）。

研究表明除MYB外，bHLH、WD40也是调节花色苷生物合成主要的转录因子。前人的研究证明bHLH 不仅可直接调节DFR表达，而且能和MYB互作共同促进花色素积累[49]。有报道指出bHLH家族的基因成员VvMYC1调节花色苷的生物合成[37]。另外，WD40的克隆和功能验证试验证明其参与葡萄果实的着色，并发现其在有色葡萄中特异表达[1]。

4 结语

由于葡萄的生物学特异性和巨大的经济价值，其一直受到研究者的关注。葡萄果皮颜色对葡萄的加工、市场价值和经济效益具有决定性作用，因此研究葡萄花色苷生物合成过程中的相关基因具有重要的意义。借助于先进的研究技术，葡萄花色苷生物合成和调控机理的研究已经显著提高。葡萄果皮中多种不同结构的花色苷已被鉴定。花色苷生物合成过程中涉及的多个结构基因已被详尽地介绍。一系列的转录因子（包括MYB家族）已被报道特异地调节花色苷合成的结构基因。然而，关于葡萄果皮花色苷的合成和调控还有许多未解之谜，如花色苷胞内运输机制、调节花色苷特异积累时期的特殊机制及花色苷和原花色苷的遗传调控机理等。目前，葡萄基因组序列已经测序完成，随着各种组学（转录组、代谢组等）研究的开展，葡萄果皮花色苷合成过程中的各类基因将得到进一步的研究。

参考文献

[1] AGEORGES A，FERNANDEZ L，VIALET S，et al.Four specific isogenes of the anthocyanin metabolic pathway are systematically coexpressed with the red colour of grape berries[J].Plant science，2006，170（2）：372-383.

[2] BOGS J，EBADI A，MCDAVID D，et al.Identification of the flavonoid hydroxylases from grapevine and their regulation during fruit development[J].Plant physiology，2006，140（1）：279-291.

[3] HARBORNE J B，WILLIAMS C A.Advances in flavonoid research since 1992[J].Phytochemistry，2000，55（6）：481-504.

[4] KOES R，VERWEIJ W，QUATTROCCHIO F.Flavonoids：A colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways[J].Trends in plant science，2005，10（5）：236-242.

[5] KENNEDY J A，MATTHEWS M A，WATERHOUSE A L.Effect of maturity and vine water status on grape skin and wine flavonoids[J].American journal of enology and viticulture，2002，53（4）：268-274.

[6] WANG W，TANG K，YANG H R，et al.Distribution of resveratrol and stilbene synthase in young grape plants（Vitis vinifera L.cv.Cabernet Sauvignon）and the effect of UVC on its accumulation[J].Plant physiology and biochemistry，2010，48（2）：142-152.

[7] BRAR H S，SINGH Z，SWINNY E.Dynamics of anthocyanin and flavonol profiles in the ‘Crimson Seedless grape berry skin during development and ripening[J].Scientia horticulturae，2008，117（4）：349-356.

[8] HE F，MU L，YAN G L，et al.Biosynthesis of anthocyanins and their regulation in colored grapes[J].Molecules，2010，15（12）：9057-9091.

[9] AZUMA A，YAKUSHIJI H，KOSHITA Y，et al.Flavonoid biosynthesisrelated genes in grape skin are differentially regulated by temperature and light conditions[J].Planta，2012，236（4）：1067-1080.

[10] BERGQVIST J，DOKOOZLIAN N，EBISUDA N.Sunlight exposure and temperature effects on berry growth and composition of Cabernet Sauvignon and Grenache in the Central San Joaquin Valley of California[J].American journal of enology and viticulture，2001，52（1）：1-7.

[11] MORI K，GOTOYAMAMOTO N，KITAYAMA M，et al.Loss of anthocyanins in redwine grape under high temperature[J].Journal of experimental botany，2007，58（8）：1935-1945.

[12] PALLIOTTI A.A new closing Yshaped training system for grapevines[J].Australian journal of grape and wine research，2012，18（1）：57-63.

[13] PASTORE C，ZENONI S，FASOLI M，et al.Selective defoliation affects plant growth，fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine[J].BMC Plant Biology，2013，13（1）：30.

[14] CASTELLARIN S D，MATTHEWS M A，DI GASPERO G，et al.Water deficits accelerate ripening and induce changes in gene expression regulating flavonoid biosynthesis in grape berries[J].Planta，2007，227（1）：101-112.

[15] ZHANG X Y，WANG X L，WANG X F，et al.A shift of phloem unloading from symplasmic to apoplasmic pathway is involved in developmental onset of ripening in grape berry[J].Plant physiology，2006，142（1）：220-232.

[16] CZEMMEL S，HEPPEL S C，BOGS J.R2R3 MYB transcription factors：Key regulators of the flavonoid biosynthetic pathway in grapevine[J].Protoplasma，2012，249（2）：109-118.

[17] GOTOYAMAMOTO N，WAN G H，MASAKI K，et al.Structure and transcription of three chalcone synthase genes of grapevine（Vitis vinifera）[J].Plant science，2002，162（6）：867-872.

[18] KOES R，VERWEIJ W，QUATTROCCHIO F.Flavonoids：A colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways[J].Trends in plant science，2005，10（5）：236-242.

[19] GIVEN N K，VENIS M A，GRIERSON D.Phenylalanine ammonialyase activity and anthocyanin synthesis in ripening strawberry fruit[J].Journal of plant physiology，1988，133（1）：25-30.

[20] BOSS P K，DAVIES C，ROBINSON S P.Analysis of the expression of anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L.cv Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation[J].Plant physiology，1996，111（4）：1059-1066.

[21] KOBAYASHI S，GOTOYAMAMOTO N，HIROCHIKA H.Retrotransposoninduced mutations in grape skin color[J].Science，2004，304（5673）：982.

[22] KOBAYASHI S，ISHIMARU M，HIRAOKA K，et al.Mybrelated genes of the Kyoho grape（Vitis labruscana）regulate anthocyanin biosynthesis[J].Planta，2002，215（6）：924-933.

[23] JEONG S T，GOTOYAMAMOTO N，KOBAYASHI S，et al.Effects of plant hormones and shading on the accumulation of anthocyanins and the expression of anthocyanin biosynthetic genes in grape berry skins[J].Plant science，2004，167（2）：247-252.

[24] HONDA T，SAITO N.Recent progress in the chemistry of polyacylated anthocyanins as flower color pigments[J].Heterocycles，2002，56（1/2）：633-692.

[25] CASTELLARIN S D，DI GASPERO G，MARCONI R，et al.Colour variation in red grapevines（Vitis vinifera L.）：Genomic organisation，expression of flavonoid 3′hydroxylase，flavonoid 3′，5′hydroxylase genes and related metabolite profiling of red cyanidin/blue delphinidinbased anthocyanins in berry skin[J].BMC Genomics，2006，7（1）：12.

[26] JEONG S T，GOTOYAMAMOTO N，HASHIZUME K，et al.Expression of the flavonoid 3′hydroxylase and flavonoid 3′，5′hydroxylase genes and flavonoid composition in grape（Vitis vinifera）[J].Plant science，2006，170（1）：61-69.

[27] SPARVOLI F，MARTIN C，SCIENZA A，et al.Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilbene biosynthesis in grape（Vitis vinifera L.）[J].Plant molecular biology，1994，24（5）：743-755.

[28] GOLLOP R，EVEN S，COLOVATSOLOVA V，et al.Expression of the grape dihydroflavonol reductase gene and analysis of its promoter region[J].Journal of experimental botany，2002，53（373）：1397-1409.

[29] FLAMINI R，TOMASI D.The anthocyanin content in berries of the hybrid grape cultivars Clinton and Isabella[J].Vitis，2009，39（2）：79-82.

[30] LIANG Z C，WU B H，FAN P G，et al.Anthocyanin composition and content in grape berry skin in Vitis germplasm[J].Food chemistry，2008，111（4）：837-844.

[31] ZHAO J，DIXON R A.The ‘ins and ‘outs of flavonoid transport[J].Trends in plant science，2010，15（2）：72-80.

[32] ZHAO L，YAGIZ Y，XU C，et al.Muscadine grape seed oil as a novel source of tocotrienols to reduce adipogenesis and adipocyte inflammation[J].Food & function，2015，6（7）：2293-2302.

[33] KLEIN J.The grapes of incompatibility[J].Developmental cell，2006，10（1）：2-4.

[34] FRANCISCO R M，REGALADO A，AGEORGES A，et al.ABCC1，an ATP binding cassette protein from grape berry，transports anthocyanidin 3Oglucosides[J].The plant cell online，2013，25（5）：1840-1854.

[35] AZUMA A，KOBAYASHI S，MITANI N，et al.Genomic and genetic analysis of Mybrelated genes that regulate anthocyanin biosynthesis in grape berry skin[J].Theoretical and applied genetics，2008，117（6）：1009-1019.

[36] TERRIER N，TORREGROSA L，AGEORGES A，et al.Ectopic expression of VvMybPA2 promotes proanthocyanidin biosynthesis in grapevine and suggests additional targets in the pathway[J].Plant physiology，2009，149（2）：1028-1041.

[37] CUTANDAPEREZ M C，AGEORGES A，GOMEZ C，et al.Ectopic expression of VlmybA1 in grapevine activates a narrow set of genes involved in anthocyanin synthesis and transport[J].Plant molecular biology，2009，69（6）：633-648.

[38] HICHRI I，BARRIEU F，BOGS J，et al.Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway[J].Journal of experimental botany，2011，62（8）：2465-2483.

[39] TIAN Q G，GIUSTI M M，STONER G D，et al.Screening for anthocyanins using highperformance liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry with precursorion analysis，production analysis，commonneutralloss analysis，and selected reaction monitoring[J].Journal of chromatography A，2005，1091（1/2）：72-82.

[40] HICHRI I，HEPPEL S C，PILLET J，et al.The basic helixloophelix transcription factor MYC1 is involved in the regulation of the flavonoid biosynthesis pathway in grapevine[J].Molecular plant，2010，3（3）：509-523.

[41] HOLTON T A，CORNISH E C.Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J].The plant cell，1995，7（7）：1071-1083.

[42]SPRINGOB K，NAKAJIMA J，YAMAZAKI M，et al.Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins[J].Natural product reports，2003，20（3）：288-303.

[43] OWENS C L.Pigments in grape[M]//Pigments in fruits and vegetables.New York：Springer，2015：189-204.

[44] DELUC L，BARRIEU F，MARCHIVE C，et al.Characterization of a grapevine R2R3MYB transcription factor that regulates the phenylpropanoid pathway[J].Plant physiology，2006，140（2）：499-511.

[45] KOBAYASHI S，ISHIMARU M，HIRAOKA K，et al.Mybrelated genes of the Kyoho grape（Vitis labruscana）regulate anthocyanin biosynthesis[J].Planta，2002，215（6）：924-933.

[46] BOGS J，JAFF F W，TAKOS A M，et al.The grapevine transcription factor VvMYBPA1 regulates proanthocyanidin synthesis during fruit development[J].Plant physiology，2007，143（3）：1347-1361.

[47] DELUC L，BOGS J，WALKER A R，et al.The transcription factor VvMYB5b contributes to the regulation of anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in developing grape berries[J].Plant physiology，2008，147（4）：2041-2053.

[48] NAKATSUKA T，HARUTA K S，PITAKSUTHEEPONG C，et al.Identification and characterization of R2R3MYB and bHLH transcription factors regulating anthocyanin biosynthesis in gentian flowers[J].Plant and cell physiology，2008，49（12）：1818-1829.

[49] WALKER A R，LEE E，BOGS J，et al.White grapes arose through the mutation of two similar and adjacent regulatory genes[J].The plant journal，2007，49（5）：772-785.