吕新美　杨宗英　姜莺颖　董亚萍　胡鲲　杨先乐

摘要[目的]研究立达霉在草鱼体内的代谢机制。[方法]采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法，检测草鱼在立达霉单次口灌200mg/kg，浸泡9mg/L剂量条件下，其肝脏组织中立达霉原药含量及代谢产物的种类，研究立达霉在草鱼肝脏组织中的代谢机制。[结果]在口灌组及浸泡组，肝脏组织中的立达霉以原药（M0）为主，高于75.00%；立达霉在草鱼体内代谢产物主要有4种，分别为代谢物N-（2-羧基-6-苯甲基）-N-（甲氧乙酰基）丙氨酸、N-[（2-羟甲基）-6-甲苯基]-N-（羟乙酰基）丙氨酸、N-（2，6-二甲苯基）-N-（羟乙酰基）丙氨酸和N-（2-羟甲基-6-苯甲基）-N-（甲氧乙酰基）丙氨酸甲酯，各代谢产物所占比例均小于10.00%。[结论]立达霉在草鱼肝脏组织中残留应以立达霉原药作为残留检测标识物。

关键词 立达霉；草鱼；代谢；残留；标识物

中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）11-0161-03

立达霉（Ridomil）是Ciba—Geigy公司（瑞士）的Schwinn于1977年首先报导的新型高效内吸杀菌剂，其通用名称为metalaxyl（英国标准协会认可、国际标准化组织建议），代号为CGA48988。立达霉属于苯甲酰胺类农药，常用作系统性真菌剂，用于作物的病原性真菌防治，效果良好。立达霉中文商品名为瑞毒霉、甲霜安、瑞多霉、甲霜灵、阿普隆、保种灵、瑞毒霜、雷多米尔、氨丙灵等，可用于马铃薯、葡萄、烟草、酒花、玉米、小米、高粱、棉花等多种农作物，作为叶面喷雾、拌种和土壤处理药剂。在水产养殖实践中也常被用于防治水产动物由水霉菌引起的疾病，其对卵菌纲有较强的防治效果。

目前关于立达霉代谢产物的研究主要集中在其药物残留检测上，如立达霉在水稻、西瓜、烟叶、马铃薯等作物上的残留消除规律。在这些研究中药物残留检测的标识物为立达霉的原药。而是否应该以立达霉作为检测标识物的文章鲜见发表。笔者以草鱼为对象，利用高效液相色谱一质谱联用的方法，检测立达霉在草鱼肝脏组织中的代谢情况，为确立立达霉在草鱼体内的残留检测标识物提供理论依据。

1材料与方法

1.1仪器与设备 Aglient-1100型高效液相色谱仪配自动进样器和荧光检测器（美国Aglient公司）；APl4000Q-trap液相色谱一串联质谱仪（美国应用生物系统公司）配TurboI-onSpray离子源，Analyst1.5.1软件；TurboV印LV型吹氮浓缩仪（美国Zymark公司）；T25型均质器（德国IKA公司）；高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；AT204-IC型分析天平（瑞士梅特勒公司）精密电子天平；涡旋振荡器；超声波清洗仪；微孔滤膜（0.22μm，颇尔，Whatman，美國）。

1.2药品与试剂 立达霉原料药由长沙拜特生物科技研究所有限公司提供。立达霉对照品购自北京世纪奥科生物技术有限公司，德国Dr.Ehrenstorfer，CAS编号57837-19-1（水分含量0.1%，检测纯度为99%，耐受性/不确定性±0.5%，卡尔·费歇尔滴定法测定）。甲酸、甲醇、甲醛均为色谱纯。

1.3养殖条件 试验用健康草鱼均购自上海浦东孙农水产养殖场，平均体重为（250±10）g，将草鱼放置于提前用高锰酸钾消毒后的水族箱（100cm×80cm×50cm）中暂养7d，暂养期间每2d换1次水，每次换水量为1/3。试验用水为充分曝气后的自来水，充气泵持续进行充氧。试验期间使用加热棒进行控温，水温为（25±1）℃。

1.4方法

1.4.1给药方式和取样。试验用草鱼共1080尾，随机分为3组，每组3个重复，1组空白对照，1组口灌，1组浸泡。在给药前采集空白肝脏组织，口灌组以200mg/kg的剂量进行口灌，无回吐者保留试验；浸泡组以9mg/L的浓度进行浸泡。口灌和浸泡组，在给药3h后分别取肝脏组织样品，并将取得的样品置于-80℃下保存。

1.4.2样品的前处理。

1.4.2.1提取。将样品从低温冰箱中取出，置于室温解冻。准确称取5g肝脏匀浆组织于50mL离心管中，加入20mL甲醇，涡旋振荡5min，8000r/min离心10min，取上清液置于另1个干净的100mL离心管中；用20mL甲醇重复提取1次后，合并上清液，在合并的上清液中加入40mL正己烷，涡旋振荡后，静置10min，取下层清液，待净化。

1.4.2.2净化。C₁₈固相萃取小柱净化；加3mL的乙腈活化固相萃取小柱；用3mL的水淋洗，除去小柱内原有的杂质；将待净化的样品提取液加入固相萃取小柱；再用3mL的水淋洗，除去小柱内残留的杂质；最后用3mL的乙腈将药物从小柱内洗脱下来，待浓缩。

1.4.2.3浓缩。将洗脱液用N₂在30℃条件下吹干，再用1mL流动相充分溶解，经O.45μm微孔滤膜过滤，上机测定。

1.4.3HPLC参数。色谱柱：反相色谱柱C₁₈柱（4.6mm×250mm），柱温30℃，流动相：0.1%的甲酸水溶液（A）和10%（V/V）甲醇甲醛溶液（B），洗脱梯度如下：0～0.5min，5%B；>0.5～2.0min，5%～25%B；>2.0～3.0min，25%～80%B；>3.O-4.0min，80%～95%B。检测波长210nm，流速0.3mL/min，进样量5μL。

1.4.4质谱参数。离子源为电喷雾电离源，采用正离子检测模式，干燥气体N₂，温度为350℃，流速为10L/min；雾化气体N₂，雾化器压力为2.8×10⁵Pa；鞘气气体N2，温度为360℃，流速为12L/min；毛细管电压为4000V，喷嘴电压为0V。

1.4.5代谢产物分析。准确称取5g肝脏匀浆组织，分别按样品处理方法处理后进样分析。给药组及空白组样品均分别在正、负离子下采用一级扫描（m/z100～1000）获得总离子流图。比较给药组及空白组总离子流图，鉴别出代谢产物色谱峰及其准分子离子。分别对其准分子离子进行二级质谱破碎，获得二级质谱图，结合其准分子离子信息、二级离子碎片信息以及原形化合物结构，对代谢产物结构进行分析。

2结果与分析

2.1草鱼体内立达霉及其代谢产物的HPLC-MS/MS定性分析 在给药后的草鱼肝脏中共发现7个具有给药依赖性的色谱峰，其中选择测定的标记为（M0～M4）。肝脏样品中立达霉及其代谢产物的色谱见图1。从色谱图上可以看出，原药M0在鱼体内被分解代谢所占比例较低，产生的6种主要代谢产物中M3相对较高，提示生成M3的通路可能是立达霉代谢的重要途径。

2.1.1原药M0的HPLC—MS/MS分析。在一级负离子全扫描质谱中观察到其准分子离子为m/z279.1471，色谱保留时间为9.6min时出现一个色谱峰（图2），命名为M0，又对其进行色谱行为、准分子离子质荷比以及碎片离子分析，其均与立达霉对照品一致，据此确定M0是未被代谢的原药。

2.1.2代谢产物M1的HPLC-MS/MS分析。在一级负离子全扫描质谱中观察到其准分子离子为m/z472.1813，色谱保留时间为7.1min（图2），命名为M1。二级全扫描质谱中观察到m/z472.1802的碎片离子（图3），经分析为准分子离子由于质量数为176u的中性丢失生成，故推测其为葡萄糖醛酸苷。由于M1较立达霉（m/z2401.3000）质量数多192，推测其为立达霉氧化后又发生葡萄糖苷醛酸化的产物，为N-（2，6-二甲苯基）-N-（羟乙酰基）丙氨酸。

2.1.3代谢产物M2的HPLC-MS/MS分析。在一级负离子全扫描质谱中观察到其准分子离子为m/z296.1493，色谱保留时间为7.9～8.2min（图2），命名为M2，其是所有代谢产物中质谱响应较高的产物。二级全扫描质谱中观察到m/z296.1450（图3）的碎片离子，由于m/z196.1450较立达霉准分子量多16，推测M2为立达霉的氧化产物，为N-（2-羟甲基-6-苯甲基）-N-（甲氧乙酰基）丙氨酸甲酯。

2.1.4代謝产物M3的HPLC-MS/MS分析。在一级负离子全扫描质谱中观察到其准分子离子为m/z252.1230，色谱保留时间为8.4min（图2），命名为M3。进一步的二级质谱碎裂模式中，观察到碎片离子m/z252.1220（图3）较立达霉准分子量少28，推测其为立达霉的双脱甲基产物，推测M3为立达霉经过双脱甲基代谢产物，为N-（2-羧基-6-苯甲基）-Nv（甲氧乙酰基）丙氨酸。

2.1.5代谢产物M4的HPLC-MS/MS分析。在一级负离子全扫描质谱中观察到其准分子离子为m/z266.1387，色谱保留时间为9.0min（图2），命名为M4。在准分子离子的二级全扫描质谱中准分子量为m/z266.1404（图3）。由于M4较立达霉准分子量少14，推测其为立达霉的单脱甲基产物，为N-[（2-羟甲基）-6-甲苯基]-N-（羟乙酰基）丙氨酸。

2.2草鱼体内立达霉代谢产物的定量分析 在浸泡、灌胃给药立达霉3h后，取草鱼肝脏样品，分析各种产物的峰面积比例（表1）。试验结果表明，在浸泡组及口灌组中，肝脏组织中的立达霉以原药（MO）为主，其峰面积所占比例分别为76.62%、75.65%，均高于75.00%，在浸泡组其代谢产物M1、M2、M3、M4峰面积所占比例分别为1.64%、6.24%、8.87%、1.94%；而在口灌组，立达霉代谢产物M1、M2、M3、M4峰面积所占比例分别为1.17%、6.22%、9.87%、2.09%。

3讨论

该试验用的是液质联用技术，其把液相色谱和质谱连接起来，利用的是内喷射式和粒子流式接口的技术。它的工作原理是通过电离等方式，破坏中性化合物分子，使其产生分子离子和碎片离子，这些离子按照质量和电荷之比（m/z）的大小顺序被记录下，形成质谱图，从而实现对化合物的分析检测。HPLC-MS/MS技术与其他技术相比，其质谱系统有卓越的灵敏度能够确保对超痕量的最低检测，同时其还具有高性能和可靠性的特点。该试验采用HPLC-Ms/MS检测方法，结果表明在口灌组及浸泡组，肝脏组织中的立达霉以原药（M0）为主，高于75.00%；立达霉在草鱼体内代谢产物主要有4种，分别为N-（2-羧基6-苯甲基）-N-（甲氧乙酰基）丙氨酸、N-[（2-羟甲基）6-甲苯基]-N-（羟乙酰基）丙氨酸、N-（2，6二甲苯基）-N-（羟乙酰基）丙氨酸和N-（2-羟甲基-6-苯甲基）-N-（甲氧乙酰基）丙氨酸甲酯，各代谢产物所占的比例均小于10.00%。

因此，立达霉在草鱼组织中残留应以立达霉原药作为残留检测标识物。